用单分子方法研究解旋酶与G4 DNA的作用机理

摘要

解旋酶(Helicase)是一类通过水解三磷酸核苷(通常是三磷酸腺苷(ATP))打开核酸之间氢键的马达蛋白。其广泛存在于每个物种中并且几乎参与了核酸代谢的各个方面。解旋酶突变将会导致核酸代谢紊乱，甚至会导致严重的遗传性疾病，如人类RecQ家族解旋酶RecQ2/Bloom(BLM)、RecQ3/Werner(WRN)、RecQ4/RTS突变将会分别导致BLM综合征、WRN综合征和Rothmund-Thomson综合征。这些病人通常表现为基因组不稳定及易患癌症。解旋酶不仅可以解旋传统的双链结构，还可以解旋Holliday连接体、G-四链体(G-quadruplex，G4)等复杂结构。
　　G4是一类非常规的核酸高级结构。其基本组成单元是四个鸟苷酸通过Hoogsteen氢键形成的平面。当不少于两个鸟苷酸平面被Na+或K+稳定，就形成了G4。G4 DNA在复制、转录、端粒代谢等生物过程中都发挥了极其重要的作用，所以如果G4不能被正确处理将会导致各种疾病。G4的生物功能是通过动态的折叠和打开实现的。在细胞内，G4可以自发折叠，但其打开是由专门的解旋酶来完成的，例如Pif1、FancJ、BLM、WRN等。在体外理解这类解旋酶解旋G4 DNA的机制以及G4 DNA对这类解旋酶的影响有助于预测其在体内的行为，然后了解它们的生物功能。但由于研究手段的限制，解旋酶与G4 DNA相互作用的分子机理尚不清楚。近二十年来，单分子技术（例如光镊、磁镊、单分子荧光共振能量转移）的进步极大地提升了我们实时观察解旋酶与核酸相互作用的能力。本文利用单分子荧光共振能量转移技术的优势，系统地探究了解旋酶Pif1、BLM和WRN与G4 DNA的相互作用，揭示了前所未有的反应细节。
　　Pif1与G4 DNA相互作用的实验结果表明:(1) Pif1以位移的方式分步并且往复打开G4 DNA;(2) Pif1往复打开G4受到ATP浓度的调节;(3) Pif1往复打开G4不需要5'尾链;(4) Pif1以单体形式打开G4;(5)G-三链体在Pif1往复打开G4过程中发挥重要作用;(6)高浓度Pif1解旋双链DNA前表现出短暂停顿的现象，对应着Pif1同源二聚体的形成;(7)G4可以明显缩短Pif1解旋双链DNA的等待时间;(8)G4促进解旋的现象在复制叉处表现的更为明显;(9)更高浓度的Pif1通过加快二聚化减少等待时间;(10)富含G的序列而不是G4结构促进Pif1解旋下游双链。
　　BLM与G4 DNA相互作用的实验结果表明:(1) G4 DNA在生理条件下可以折叠成两种结构，并且Mg2+也可以稳定G4结构;(2) BLM解旋G4是依赖于ATP的;(3)当G43'末端只含有单链DNA的情况下，BLM分步阶梯式以G-三链体、G-发卡结构为中间状态打开G4 DNA;(4)当G43'端通过一段单链DNA连接双链DNA的情况下，BLM锚定在单双链叉口抽动单链DNA，挤出单链DNA环，循环打开G4 DNA;(5) BLM打开G4结构的能力较弱，不能打开稳定的四层G4结构，同时G4是BLM位移的障碍。
　　WRN与G4 DNA相互作用的实验结果表明:(1)WRN在叉状、单双链和含有G4的DNA结构上表现出循环解旋现象，显示出表观持续解旋能力弱;(2) WRN可以锚定在单双链叉口抽动5'单链DNA，诱导单链DNA往复成环;(3)循环解旋来自相同WRN沿着同一条单链DNA的往复运动，而不是不同解旋酶的解离和结合，或相同解旋酶的链转换;(4)G4在不同结构环境下均表现出阻挡WRN位移和解旋下游双链的现象;(5)G4序列的互补链或G43'端多出的双链锚定位点可以促进WRN解旋G4下游的双链DNA。
　　总之，上述解旋酶解旋G4过程中均表现出分步解旋和循环解旋的现象但分子机理不同。而对于不同的解旋酶来说，G4对于下游双链DNA解旋的影响有时表现为激活有时表现出抑制。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 解旋酶

1．1．1 解旋酶概述

1．1．2 解旋酶的分类

1．1．3 解旋酶的性质

1．1．4 解旋酶的工作模型

1．2 单分子技术

1．2．1 单分子概述

1．2．2 磁镊

1．2．3 光镊

1．2．4 单分子荧光

1．3 G4 DNA及其解旋酶

1．3．1 G4 DNA及功能

1．3．2 G4 DNA的物化性质

1．3．3 G4 DNA解旋酶及进展

1．3．4 G4研究手段及进展

1．4 研究目的和意义

第二章 单分子荧光共振能量转移

2．1 全内反射荧光显微镜

2．2 单分子荧光共振能量转移原理及进展

2．2．1 原理简介

2．2．2 荧光对选择

2．2．3 技术进展

2．3 单分子荧光显微镜构建

2．4 实验步骤

2．4．1 准备工作

2．4．2 样品池制备

2．4．3 实验过程

第三章 Pif1解旋G4以及G4激活下游双链解旋的机理

引言

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 Pif1p催化的G4 DNA往复打开和折叠

3．2．2 Pif1p往复打开G4受到ATP浓度调节

3．2．3 Pif1p打开没有尾链的G4

3．2．4 Pif1p以单体形式打开G4

3．2．5 Pif1p解旋G4的分子机制

3．2．6 高浓度Pif1p解旋双链DNA前表现出等待

3．2．7 G4明显缩短等待时间

3．2．8 高浓度Pif1p通过二聚化减少等待时间

3．2．9 富含G序列促进Pif1p解旋下游双链

3．2．10 G4在复制叉处促进解旋更明显

3．3 讨论

第四章 BLM解旋酶与G4 DNA相互作用的现象及机理

引言

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 BLM催化G4打开依赖于ATP

4．2．2 BLM分步阶梯式打开dG4s

4．2．3 高浓度ATP情况下BLM与dG4s反应的性质

4．2．4 BLM催化的G4sd解旋

4．2．5 G4sd的一步降低是BLM结合而不是G4打开

4．2．6 BLM循环抽动单链DNA及其性质

4．2．7 重新思考BLM的链转换行为

4．3 讨论

第五章 WRN解旋酶与DNA相互作用的现象及机理

引言

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．2 结果与分析

5．2．1 WRN与叉状结构的反应

5．2．2 WRN沿着单链DNA往复运动

5．2．3 WRN诱导5’单链DNA环化

5．2．4 G4结构调节WRN在不同结构环境中的活性

5．2．5 G4互补链和额外锚定位点加速解旋的机制

5．3 讨论

第六章 结论

参考文献

附录

缩略词

致谢

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