基于功能寡核长苷酸分子的蛋白质检测新方法研究

摘要

自人类进入后基因组时代以来,建立简单、灵敏、快速、特异性强、高通量的蛋白质检测方法,已成为分析科学的研究重点之一。蛋白质参与生命体每一步反应和活动,与许多人类疾病有着直接的关系,因此实现蛋白质准确灵敏的检测,对疾病诊治均具重要意义。
　　适配体及脱氧核酶是近年来经体外指数富集配基的系统进化技术( SELEX)筛选出的两类寡核苷酸功能分子。适配体识别机制与抗体相似,但与靶分子间作用的特异性和亲和力更高,且具有靶分子范围更加广泛、无免疫原性、稳定性强、可构筑良好的纳米功能器件等诸多优点;脱氧核酶则为具有酶催化活性的小分子单链DNA(ssDNA),可在辅酶因子如金属离子、氨基酸的作用下,发挥高效的催化活性,具有易于合成和修饰及稳定性好等特点,作为新型的亲和分子,适配体和脱氧核酶在识别传感与检测领域备受关注。
　　本研究论文则鉴于适配体与靶蛋白高亲和力高特异性的结合性质及脱氧核酶的高催化活性,构建了基于适配体或适配体与脱氧核酶有机整合的新型分子识别与分析检测体系,从而实现对于靶蛋白高灵敏度、高特异性检测的目的。本论文共分5章。
　　第一章为前言部分,围绕着适配体及脱氧核酶在分析化学领域的应用这一重点,从适配体的定义与特点、适配体在分离分析及生物传感领域中的应用、脱氧核酶的定义与功能分类、脱氧核酶(包括变构脱氧核酶)在生物传感领域的应用等诸方面展开综述,共引用文献86篇。亦简要介绍了本论文的创新点与研究工作;
　　第二章利用磁珠作为分离介质,构建了一种基于适配体夹心法检测凝血酶的比色传感新方法。该方法简便易行,可用裸眼直接观测。利用磁珠比表面积大,可磁性分离的优点以及适配体的性质,可实现5％及50％血清中凝血酶的比色检测,在5％血清中,凝血酶线性范围为10～80 nM,检测限(LOD)为10nM。G15D适配体5’末端连接臂的长短对凝血酶检测灵敏度具有显著影响,在其5’末端引入6T连接臂能显著提高与凝血酶的结合能力;在对适配体连接臂长度优化后,适配体G15D及60-18[29]都可作为捕获适配体,实现凝血酶的定量检测;
　　第三章基于新型适配体荧光探针SF-39mer,建立了一种定量检测rHuEPO-o的亲和探针毛细管电泳-激光诱导荧光检测(APCE/LIF)新方法,并探讨了适配体与rHuEPO-c间的相互作用机制。各种APCE条件的优化表明,溶液微环境中存在的Na+离子是 SF-39mer-rHuEPO-a复合物存在与否的关键调控因素,运行缓冲液中Na+的存在可显著提高复合物及与游离适配体之间的分离度,而样品溶液中的Na+则可使复合物峰强度显著升高;另外,适当的电压和样品溶液添加剂(牛血清白蛋白)也是复合物稳定存在的必需条件。在最优的实验条件下,该方法可成功用于生理缓冲液、人工尿液及血清基质中rHuEPO-a的高灵敏,高特异性的检测,线性范围为0.2～100 nM,LOD为0.2 nM,,也可用于实际样品(人促红细胞生成素rHuEPO-α,注射液)中rHuEPO-α的准确定量。利用APCE/LIF技术还探讨了N连接位点的糖基在适配体与rHuEPO-α结合时所发挥的作用;
　　第四章中成功实现了生物素化的脱氧核酶一适配体连接体在链霉亲和素(STV)包被的磁珠或毛细管柱端的自组装,结合磁珠、CE等分离技术,建立了一类基于适配体分子特异性捕获富集、脱氧核酶催化剪切洗脱及检测蛋白质的新方法。首先详细考察了Cu2+依赖型的CA311-43mer型脱氧核酶在自由溶液、固相介质如磁珠表面的催化活性的影响因素;在此基础上,把凝血酶适配体序列引入到CA311-43mer底物链的5’端,将其固定于STV包被的磁珠表面对凝血酶进行捕获,通过测定脱氧核酶的催化切割活性实现凝血酶的定量检测;结合溴化己二甲铵(HDB)/STV层层组装技术则可成功实现脱氧核酶一适配体连接体在毛细管柱端的自组装,通过监测脱氧核酶切割产生的凝血酶一适配体复合物的荧光强度实现凝血酶的高灵敏检测,检测限可达nM级;
　　第五章利用磁珠作为分离介质,首次将依赖Cu2+的脱氧核酶与凝血酶适配体结合,构建了一种基于适配体型变构脱氧核酶定量检测凝血酶的新型传感体系。通过优化脱氧核酶I区碱基配对数目、脱氧核酶I区与适配体互补碱基数目、脱氧核酶与适配体浓度比例等主要因素,实现了适配体对酶切割活性的抑制,而凝血酶的加入则可促使脱氧核酶切割活性的恢复,通过监测酶切割产生的荧光信号实现凝血酶的定量检测。该体系简单、成本低,特异性好,无需标记适配体,普适性强,LOD为5.1nM,线性范围为0-100nM,为蛋白质的检测提供了新的分析平台。

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缩略词表

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第一章 前言

第二章 基于磁珠和适配体的蛋白质比色分析

第三章 一种基于配体的APCE/LIF新方法：rHuEPO-α的高灵敏度检测与相互作用研究

第四章 脱氧核酶-适配体在固相基质上的自组装及对于靶蛋白的特异捕获与识别

第五章 基于适配体型变构脱氧核酶构建新型蛋白质传感体系

结论

参考文献

附录：攻读学位期间发表文章目录

脱氧核酶在生物传感领域的研究进展

参考文献

基于磁珠分离的酶联适配体测痕量蛋白质的新型比色分析方法

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