猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备及免疫原性评价

摘要

断奶仔猪多系统衰弱综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)主要是由猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）引起的以生长缓慢、高度呼吸困难、严重腹泻、黄疸、淋巴结极度肿大等为典型特征的疾病，多发猪群是6～16周龄的仔猪。我国自从2000年首次发现该病以来，现在已经有20多个省、自治区、直辖市发现猪群中有PCV2的感染，阳性率为21％～96％。同时，PCV2进入机体后，能够破坏机体免疫系统，导致免疫力降低，造成与其他疾病的混合感染。因此，每年由该病造成的经济损失非常巨大。
　　目前该病没有有效的治疗方法，疫苗免疫已经被证明是最有效的防控途径。传统的灭活疫苗存在着病毒增殖滴度低、生产成本高等问题，同时该类疫苗也有灭活不彻底的风险，目前已经逐渐被亚单位疫苗取代，尤其是圆环病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)疫苗。
　　Cap蛋白由于是圆环病毒唯一的结构蛋白，自身能够组装成VLPs，并且免疫后可诱导针对PCV2的完全保护性免疫，因此成为圆环亚单位疫苗研究的首选抗原。本论文根据实验室分离鉴定的PCV Cap基因序列，按照酵母密码子偏好性，进行密码子优化，构建了Cap蛋白的酵母表达载体，实现其分泌表达及VLPs组装，并用小鼠模型进行动物试验评价免疫效果，结果如下:
　　1.成功构建了重组质粒pPICZα-A-AHCap、pPICZα-A-AHCap-Fla、pPICZα-A-SUMO-AHCap和酵母表达菌株GS115-pPICZα-A-AHCap、GS115-pPICZα-A-AHCap-Fla、GS115-pPICZα-A-SUMO-AHCap。
　　2.利用以上构建的酵母表达菌株，成功获得了重组蛋白AHCap、AHCap-Fla、SUMO-AHCap。
　　3.透射电镜观察纯化后的重组蛋白，结果发现:融合了SUMO标签的Cap蛋白(SUMO-AHCap)没有VLPs的形成，N端缺失32个氨基酸的AHCap以及在C端融合flagellin佐剂的AHCap(AHCap-Fla)明显可以看到直径在20nm左右的VLPs，并且重组蛋白AHCap形成的VLPs比AHCap-Fla多。
　　4.将纯化的重组蛋白AHCap、AHCap-Fla定量后制备亚单位疫苗，免疫小鼠检测其免疫原性。间接ELISA结果显示试验组小鼠血液中均含有PCV2的特异性抗体和中和抗体，IFN-γ和IL-2表达量均升高，并且在攻毒后的小鼠血清中未检测到病毒，而免疫重组蛋白AHCap-Fla的抗体滴度和细胞因子（IFN-γ、IL-2）分泌高于IFN-γ、IL-2组，说明重组蛋白AHCap-Fla和AHCap具有较好的免疫原性，但是重组蛋白AHCap-Fla的免疫效果更好。
　　综上，本文利用毕赤酵母表达系统表达的重组蛋白AHCap、AHCap-Fla都可自组装成VLPs，并都具有较好的免疫原性，以上结果为PCV亚单位疫苗的研发提供了新思路。

目录

声明

摘要

第一章 猪圆环病毒2型的概述

1．1 猪圆环病毒2型的分子特征

1．1．1 猪圆环病毒2型的分子特征

1．1．2 PCV2衣壳蛋白特征

1．1．3 猪2型圆环病毒的基因组特点

1．1．4 猪圆环病毒2型的致病性

1．1．5 PCV2的诊断技术

1．2 PCV2疫苗研究进展

1．2．1 灭活疫苗

1．2．2 PCV2弱毒疫苗

1．2．3 PCV2亚单位疫苗

1．2．4 核酸疫苗

1．2．5 PCV2疫苗存在的问题

1．3 毕赤酵母表达系统的概述

1．3．1 毕赤酵母表达系统的优点

1．3．2 毕赤酵母表达系统的缺点

1．4 病毒样颗粒

1．5 Flagellin佐剂

1．6 研究背景

1．7 研究的目的与意义

第二章 猪圆环病毒2型病毒样颗粒酵母表达载体的构建与目的蛋白表达

2．1 试验材料

2．1．1 菌株与载体

2．1．2 主要试剂与药品

2．1．3 主要仪器

2．1．4 培养基及电泳相关溶液

2．2 方法

2．2．2 构建重组质粒

2．2．3 构建酵母表达菌株

2．3 结果

2．3．1 重组质粒的构建

2．3．2 构建酵母表达菌株

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 重组蛋白病毒样颗粒的形成及免疫原性鉴定

3．1 材料

3．1．1 菌株与毒株

3．1．2 主要试剂与仪器

3．1．3 主要培养基及缓冲液

3．2 方法

3．2．1 重组蛋白的表达

3．2．2 重组蛋白检测

3．2．3 重组蛋白的电镜观察

3．2．4 重组蛋白免疫原性检测

3．3 结果

3．3．1 重组蛋白检测

3．3．2 重组蛋白电镜观察

3．3．3 重组蛋白免疫原性检测

3．4 讨论

3．5 小结

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介