铜绿假单胞菌中接头蛋白PA3293转位H2-T6SS效应物PA3290的机制研究

摘要

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种运动非发酵型的革兰氏阴性条件致病细菌，能够引发严重的急性和慢性感染。细菌通过分泌各种各样的蛋白进入胞外环境介导其与周围环境之间的相互作用，目前为止已经进化出七种专门的分泌系统来完成这个任务。Ⅵ型分泌系统(T6SS)就是其中的一种分泌系统，它是一种接触依赖型的蛋白分泌途径，负责分泌（转位）毒素效应蛋白进入细菌或真核靶细胞。
　　研究显示铜绿假单胞菌PA3290(Tle1)是一个效应蛋白，其具有磷脂酶A2的活性，能够通过T6SS进入邻近细胞的周质空间以水解邻近细胞的膜磷脂，然而它们的抗菌活性能够被同源免疫蛋白所抑制。本研究以铜绿假单胞菌作为研究材料，探究其接头蛋白PA3293（Tap-1）转位H2-T6SS效应物PA3290的机制研究。具体研究结果如下:
　　1.敲除H2-T6SS的dpV2时，供体菌和受体菌之间的竞争指数和敲除效应蛋白PA3290时的趋势都有明显下降，而敲除其他两套T6SS的dpV时竞争指数的趋势和野生型相同，均没有变化，则说明Tle1是依赖H2-T6SS的抗菌效应蛋白。
　　2.依次向受体菌△3290-3292Ptac(pME6032)中互补PA3291、PA3292和PA3291-3292，单个互补或同时互补时趋势都有所降低，说明两者都起到免疫作用，即Tle1拥有两个免疫蛋白。
　　3.生物信息学分析显示铜绿假单胞菌PAO1中存在抗原核生物的T6SS接头蛋白PA3293，与霍乱弧菌N16961中的嵌入式接头蛋白tap-1是同源的。
　　4.分别敲除效应蛋白Tle1、接头蛋白Tap-1和VgrG4a时，相应的供体菌和受体菌之间的竞争指数明显较野生型下降，而分别互补后又恢复到野生型，说明Tle1介导的杀菌作用依赖于接头蛋白Tap-1和VgrG4a，细菌双杂交和β-半乳糖苷酶活性试验证明Tap-1直接与Tle1或VgrG4a互作。
　　5.通过效应蛋白Tle1、接头蛋白Tap-1和VgrG4a的C端和N端氨基酸的截短、细菌双杂交以及β-半乳糖苷酶活性试验来鉴定Tap-1与Tle1或VgrG4a之间的互作区域，结果表明Tap-1上与Tle1的互作区域位于PA32933'端180-210位碱基所编码的氨基酸;Tle1上与Tap-1的互作区域位于PA3290600bp-1464位碱基所编码的氨基酸;Tap-1上与VgrG4a的互作区域位于PA32933'端180-270位碱基所编码的氨基酸;VgrG4a上与Tap-1的互作区域位于PA32943'端12-18位碱基所编码的氨基酸。
　　本研究为了验证铜绿假单胞菌中效应蛋白PA3290和霍乱弧菌N16961中效应蛋白TseL都能在在转位的过程中依赖VgrG和接头蛋白这一猜测，以铜绿假单胞菌PAO1为对象，拟通过竞争试验来验证PA3290的功能，且在其功能研究的基础上鉴定效应物所对应的免疫蛋白和其所依赖的杀菌作用依赖VgrG和接头蛋白，除此外还通过细菌双杂交来鉴定效应物、接头蛋白和VgrG之间的互作关系，对T6SS的分泌机理中关于效应物、接头蛋白和VgrG之间的互作关系的研究具有重要的意义。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 铜绿假单胞菌的概述

1．2．1 细菌分泌系统概述

1．2．2 T6SS的结构

1．2．3 T6SS的功能

1．2．4 T6SS的调控

1．3 铜绿假单胞菌T6SS的研究进展

1．4 细菌Ⅵ分泌系统磷脂酶的研究进展

1．4．1 细菌磷脂酶的研究进展

1．4．2 磷脂酶结构研究进展

1．4．2 霍乱弧菌中接头蛋白的研究

1．5 论文选题的依据和目的意义

2．1 材料

2．1．1 分子生物学试剂

2．1．2 培养基

2．1．3 菌种与质粒

2．1．4 引物序列

2．2 试验方法

2．2．1 大肠杆菌感受态细胞制备及热转化

2．2．2 铜绿假单胞菌电转化

2．2．3 质粒接合转移

2．2．4 基因敲除及互补

2．2．5 染色体融合报告菌株的构建

2．2．6 生长竞争试验

2．2．7 细菌双杂交

2．2．8 β-半乳糖苷酶活性的测定

2．2．9 基因截短试验

第三章 试验结果

3．2 Tle1拥有两个免疫蛋白

3．3 生物信息学分析

3．4 Tle1介导的杀菌作用依赖于接头蛋白Tap-1和VgrG4a

3．5 Tap-1直接与Tle1或VgrG4a互作

3．6 Tap-1与Tle1或VgrG4a之间互作区域的鉴定

3．6．3 Tap-1上与VgrG4a之间互作区域的鉴定

3．6．4 VgrG4a上与Tap-1之间互作区域的鉴定

3．7 Tap-1与Tle1或VgrG4a之间互作位点的保守性分析

第四章 分析与讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

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