奶牛乳腺炎中成纤维细胞分泌的SDF-1对乳腺上皮细胞的作用及机制研究

摘要

奶牛乳腺炎是由于奶牛机体代谢和生理状态改变、乳房损伤及接触传染性或环境性病原微生物等引起的乳腺炎症反应。大量的文献已经证实乳腺组织中的乳腺上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等组成了乳腺组织的细胞免疫系统，共同参与乳牛乳腺炎的免疫应答。成纤维细胞是乳腺组织中数量最多的基质细胞，但其在奶牛乳腺炎和乳腺炎迁延不愈导致乳腺纤维化中的作用及机制尚不明确。本研究通过对比从奶牛炎性乳腺组织中分离的成纤维细胞（inflammatoryfibroblasts，INFs）和从正常乳腺组织分离的成纤维细胞(normalfibroblasts，NFs)的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白和炎症相关因子的表达或分泌水平等基本生物学特性的差异，明确基质成纤维细胞是否参与在奶牛乳腺炎疾病过程中;并进一步研究了在INFs中表达明显上调的基质衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)对奶牛乳腺上皮细胞生物学功能的影响及机制，进而探究成纤维细胞在乳腺炎以及乳腺纤维化发生发展过程中的作用，这一研究对奶牛乳腺炎及纤维化的防治具有重要的意义。
　　本研究首先运用实时定量聚合酶链反应(qRCR)和蛋白印迹技术(Western blot)检测ECM蛋白Ⅰ型胶原蛋白(Collagen-1)、波形蛋白(Vimentin)及基质金属蛋白酶-1(MMP-1)基因水平和蛋白水平的表达;通过qRCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测了细胞因子和趋化因子IL-8、CXCL2和SDF-1的基因和蛋白水平的表达;通过细胞划痕实验检测两种成纤维细胞的迁移能力;利用代表大肠杆菌毒力成分的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）和代表金黄色葡萄球菌毒力成分的脂磷壁酸(lipoteichoicacid，LTA)建立体外的诱导的成纤维细胞模型检测ECM相关蛋白，细胞因子和趋化因子的蛋白水平表达。通过以上从不同角度对INFs和NFs生物学特性的对比，明确成纤维细胞是否参与奶牛乳腺的炎症过程。然后，通过建立成纤维细胞和乳腺上皮细胞的体外间接共培养模式，研究INFs对乳腺上皮细胞形态变化及EMT(epithelial-mesenchymaltransition)标志分子如α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和角蛋白(Cytokeratin)表达的影响;并进一步通过一系列分子生物学的方法研究了在INFs中高表达的SDF-1对乳腺上皮细胞的影响及分子机制。最后，通过建立SDF-1诱导的体外乳腺炎小鼠模型验证SDF-1的促炎性和促纤维化作用。
　　结果显示，Collagen-1、Vimentin、MMP-1等ECM蛋白和IL-8、CXCL2和SDF-1等炎性相关因子在INFs、LPS以及LTA诱导的成纤维细胞中的表达或分泌水平均明显高于NFs，表明成纤维细胞参与在奶牛乳腺的炎症应答过程。体外共培养结果显示，INFs可诱导乳腺上皮细胞的形态从铺路石样转变为梭形，并促进EMT标志分子α-SMA和Cytokeratin的表达，表明在共培养条件下，INFs可诱导乳腺上皮细胞发生EMT。
　　进一步的研究发现，LPS和LTA处理后的NFs，以及炎性乳腺组织中SDF-1的表达或分泌都高于正常对照组。外源性SDF-1通过激活NF-κB通路促进乳腺上皮细胞发生EMT，诱导炎症反应并抑制细胞增殖。此外，体内实验发现SDF-1在小鼠乳腺中能够诱发乳腺炎和轻微的纤维化，而SDF-1的特异性抑制剂可以减轻这一现象，结果表明INFs分泌SDF1介导其对乳腺上皮细EMT和炎性诱导过程。
　　综上所述，本研究表明奶牛乳腺在炎症状态下，基质成纤维细胞通过分泌SDF-1促进乳腺上皮细胞EMT和炎症反应的发生，进而参与乳腺炎及其迁延所致乳腺纤维化。这一发现从新的角度初步阐明了炎性状态下的乳腺间质成纤维细胞对上皮细胞的作用，为进一步探究乳腺炎及乳腺纤维化的发生机制奠定了基础。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 奶牛乳腺炎的研究进展

1．1．1 奶牛乳腺炎的概述

1．1．2 奶牛乳腺炎与奶牛免疫系统

1．1．3 奶牛乳腺炎与炎症反应

1．1．4 奶牛乳腺炎的发病机理

1．2 ECM的研究进展

1．3 EMT的研究进展

1．4 成纤维细胞的研究进展

1．4．1 成纤维细胞的基本生物学功能

1．4．2 成纤维细胞在组织器官纤维化中的作用

1．5 SDF-1生物学特性的概述

1．5．2 SDF-1／CXCR4信号通路

1．5．3 SDF-1与胚胎发育、器官发生

1．5．4 SDF-1与免疫、疾病

第二章 正常乳腺基质成纤维细胞和炎性相关成纤维细胞的功能特性对比

2．1 材料

2．1．1 组织与细胞

2．1．2 主要实验试剂与耗材

2．2 方法

2．2．1 qPCR检测ECM相关蛋白基因水平的表达

2．2．2 Western blot检测ECM相关蛋白的表达

2．2．3 ELISA检测IL-8、CXCL2、SDF-1的分泌表达

2．2．4 LPS和LTA诱导乳腺炎模型的建立

2．2．5 INFs与NFs的迁移速率的检测

2．2．6 统计分析

2．3．2 IL-8、CXCL2、SDF-1在INFs和NFs中的表达

2．3．3 LPS和LTA诱导炎性相关因子和ECM蛋白在INFs和NFs中的表达

2．3．4 INFs和NFs的迁移速率对此

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 SDF-1在炎性成纤维细胞诱导乳腺上皮细胞EMT和炎性反应中的作用

3．1 材料

3．1．1 组织与细胞

3．1．2 主要实验试剂与耗材

3．2 实验方法

3．2．1 细胞间接共培养实验

3．2．3 SDF-1处理的上皮细胞中P65的Western blot检测

3．2．6 统计分析

3．3 结果

3．3．1 INFs促进乳腺上皮细胞EMT的发生

3．3．2 乳腺炎组织中SDF-1的基因表达

3．3．4 SDF-1通过激活NF-κB通路诱导上皮细胞发生EMT

3．3．5 SDF-1诱导上皮细胞产生炎性反应

3．3．7 SDF-1诱导的小鼠乳腺炎模型

3．4 讨论

3．5 小结

全文结论

创新之处

参考文献

附录

致谢

作者简介