免疫细胞因子基因及相关miRNAs在肉鸡急性冷、热应激中的表达调控研究

摘要

高密度集约化的饲养模式极易使肉鸡产生热应激。但是，湿帘以及降温措施不当使用又极易产生冷应激。急性冷、热应激的发生首先破坏的是家禽机体的免疫机能，严重影响肉鸡的商品化生产，造成巨大的经济损失。采用现代生物检测技术研究急性冷热应激条件下肉鸡免疫细胞因子基因在各免疫器官中的表达规律，揭示micRNAs与其靶基因对急性应激的调控机理，为培育抗寒抗热肉鸡品种提供理论依据，具有重大的实际生产意义。
　　本实验以45只28日龄体重及健康状况相近的罗斯308肉鸡为研究对象，分为正常对照组、热应激组和冷应激组分别模拟实际生产产生急性热应激反应和冷应激反应。采用实时荧光定量PCR对8个免疫细胞因子基因(IL-1、IL-1α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12α、IL-12β、INF-γ)和4个热应激蛋白基因(Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp110)在脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、心脏等组织中的表达量进行测定分析。并采用miRNA测序技术对脾脏组织的miRNAs进行检测，筛选差异表达miRNAs，并预测其靶基因。进一步从细胞水平和分子水平对差异表达miRNAs与细胞因子基因互作进行验证，揭示差异miRNAs及其靶基因对急性冷热应激的调控机理。研究得到以下结果:
　　1.在脾脏组织中，只有急性热应激条件下IL-1α和IL-1两个基因表达影响显著升高(P＜0.05);在胸腺组织中，除IL-12α表达在各处理组无显著变化，其余7个细胞因子表达量均显著下降;在法氏囊组织中，各处理组均未检测到IL-12α的表达，急性热应激条件下其他7个细胞因子基因表达均显著下降(P＜0.05)。
　　2.在心脏组织与肝脏组织中，急性热应激条件下HSP70与HSP110表达极显著升高(P＜0.01)。
　　3.对脾脏组织miRNA测序结果揭示，根据|log2Fold|＞1和p value＜0.05原则，正常组和热应激组之间筛选出12个差异表达miRNAs，在正常组和冷应激组之间发现1个差异表达miRNAs，在冷应激和热应激组之间筛选出20个差异表达miRNAs。通过对所有差异表达miRNAs把基因的预测，筛选出4个差异表达miRNAs的靶基因为免疫细胞因子基因。
　　4.通过WEGO和GO Pathway通路富集分析，急性热应激条件下差异表达miRNAs显著富集在细胞因子互作的通路中。
　　5.双荧光素酶报告结果表明，gga-miR-34a-5P和gga-miR-449c-5P对IL-2和IL-12α的表达具有负调控的作用。
　　综上所述，本研究结果表明，急性热应激对免疫细胞因子的表达影响较大，尤其对胸腺组织中免疫细胞因子基因表达影响最大，而冷应激影响较小;各免疫细胞因子在不同组织中表达规律不一致;急性应激条件下，热应激蛋白Hsp70和Hsp110的表达极显著上调(P＜0.01)。gga-miR-34a-5p和gga-miR-449c-5p对细胞因子基因IL-2与IL-12有极显著下调作用(P＜0.01)，抑制了IL-2与IL-12表达水平。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 应激概述

1．1．1 热应激的概念

1．1．2 冷应激的概念

1．2 罗斯308商品肉鸡

1．3 冷应激对鸡影响的研究进展

1．3．1 冷应激对鸡生产的影响

1．3．2 冷应激对鸡免疫器官和免疫功能的影响

1．4 热应激对鸡影响的研究进展

1．4．1 热应激对鸡生产的影响

1．4．2 热应激对鸡免疫器官及免疫功能的影响

1．5 应激蛋白概况及研究进展

1．5．1 热应激蛋白60

1．5．2 热应激蛋白70

1．5．3 热应激蛋白90

1．5．4 热应激蛋白110

1．6 细胞因子概述与研究进展

1．6．1 白介素(interleukin，IL)

1．6．2 IFN

1．7 IL对应激的调控

1．7．1 IL对冷应激的调控

1．7．2 IL对热应激的调控

1．8 miRNA的研究进展

1．8．1 miRNA对鸡的免疫性能影响及研究进展

1．8．2 miRNA的功能研究概况

1．9 本研究的目的与意义

1．10 本研究技术路线

第二章 急性应激条件下免疫细胞因子基因在各免疫组织中的表达研究

2．1 材料与方法

2．1．1 试验对象与处理方法

2．1．2 主要实验试剂

2．1．3 主要实验仪器设备

2．1．4 实验步骤

2．1．5 数据处理

2．2 结果与分析

2．2．1 免疫细胞因子基因在脾脏组织中的表达

2．2．2 细胞因子基因在胸腺组织中的表达

2．2．3 细胞因子基因在法氏囊组织中的表达

2．2．4 应激蛋白基因在心脏组织中的表达

2．2．5 应激蛋白基因在肝脏组织中的表达

2．3 讨论

2．3．1 急性应激条件下免疫细胞因子基因在各免疫组织中的表达规律不一致

2．3．2 急性应激条件下HSP70和HS110在心脏和肝脏中表达量急剧上升

2．4 小结

第三章 gga-miR-34a-5p和gga-miR-449c-5p对细胞因子基因的调控研究

3．1 材料与方法

3．1．1 试验动物与材料

3．1．2 主要实验试剂

3．1．3 主要实验仪器设备

3．1．4 实验步骤

3．1．5 数据处理

3．2 结果与分析

3．2．1 脾脏组织miRNA测序结果

3．2．2 双荧光素酶检测结果

3．2．3 荧光定量结果分析

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介