玉米磷酸乙醇胺氮甲基转移酶(PEAMT)基因启动子的克隆和功能分析

摘要

甜菜碱是一种无毒渗透保护剂，在非生物胁迫条件下大量积累来维持细胞的渗透压，保证植物的正常生长。磷酸乙醇胺氮甲基转移酶(phosphoethanolamine methyltransferase，PEAMT)作为甜菜碱合成的关键酶，其基因表达受上游启动子的调节。目前关于玉米（Zea mays L.）内源PEAMT基因启动子的研究较少。本研究以玉米自交系B73(cv.B73)为材料，根据NCBI数据库(national center for biotechnology information)中玉米PEAMT基因序列设计引物，利用普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)克隆其上游5'侧翼序列。通过构建含有玉米PEAMT启动子全长和缺失片段融合β-葡萄糖苷酸酶报告基因（GUS）的表达载体并转化烟草（Nicotiana benthamianaL.），利用组织化学染色和GUS酶活性分析确定PEAMT基因启动子全长和不同缺失片段响应干旱（15％PEG-6000，m/v）、盐(100mmol·L-1NaCl)、低温(4℃)和氧化胁迫（100mmol·L-1H2O2）等非生物胁迫的能力。主要研究结果如下:
　　1.根据NCBI数据库玉米PEAMT基因序列设计引物，克隆了PEAMT启动子序列，序列长度为1048bp（序列信息详见附录一）。利用在线预测软件Promoter prediciton、PLACE和PlantCare预测出该序列中存在17个非胁迫应答顺式作用元件、13个光诱导信号转导元件、9个激素应答顺式作用元件以及5个花粉发育特异性激活元件等。
　　2.构建了PEAMT基因启动子融合GUS报告基因表达载体并转化烟草，发现克隆得到的PEAMT基因启动子能够驱动GUS基因的高效表达。经过GUS酶活性分析，PEAMT基因启动子呈正调控表达模式，在干旱、盐、低温和氧化胁迫下的活性分别为27.4、39.9、23.5和19.7nmol4-MU·min-1·mg-1protein，与对照(3.44nmol4-MU·min-1·mg-1protein)相比分别提高了1.64倍、2.84倍、1.47倍和3.59倍。
　　3.进一步对该启动子进行5'端缺失分析，克隆了4种不同长度的5'端缺失片段，序列长度分别为826bp(P2)、642bp(P3)、428bp(P4)和245bp(P5)。将这些启动子片段与GUS报告基因融合构建表达载体，获得含有不同缺失启动子片段的阳性转化植株。GUS组织化学染色结果表明，4种启动子缺失片段均具有表达活性。GUS酶活性结果表明，不同类型的非生物胁迫均能诱导不同缺失片段启动子活性的增加。其中，P3片段启动子在干旱和低温胁迫条件下的表达量均相对较高，分别为37.18和19.76nmol4-MU·min-1·mg-1protein，与对照相比分别增加了4.76倍和5.33倍;P4片段启动子在盐胁迫处理下的表达量较高，为36.46nmol4-MU·min-1·mg-1protein，与对照相比增加了6.12倍;P2片段启动子在氧化胁迫下的表达量较高，为20.50nmol4-MU·min-1·mg-1protein，比对照增加了7.51倍。由此可见，不同缺失片段对以上4种非生物胁迫的响应程度存在差异，其中P3片段启动子对多种非生物胁迫均较为敏感。
　　本文初步揭示了玉米PEAMT基因启动子的序列特征和表达特点，该启动子具有响应非生物胁迫的能力，且呈现正调控的表达模式，这为进一步深入研究PEAMT基因的表达调控提供了理论基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 研究背景概述

1．2 植物基因启动子研究进展

1．2．1 植物基因启动子的结构

1．2．2 植物基因启动子的克隆方法

1．2．3 植物基因启动子的研究方法

1．2．4 植物基因启动子的分类和研究进展

1．3 磷酸乙醇胺甲基转移酶(PEAMT)的作用及研究现状

1．3．1 植物细胞内PEAMT的反应作用机理

1．3．2 PEAMT通过促进甜菜碱的合成提高植物抗逆性

1．3．3 PEAMT介导磷脂酸合成的双向调控机制

1．4 研究目的与意义

第二章 PEAMT基因启动子克隆及生物信息学分析

2．1 材料与试剂

2．2 材料培养

2．3 试验方法

2．3．1 玉米基因组DNA的提取

2．3．2 启动子全长的克隆

2．3．3 启动子序列分析

2．4 结果与分析

2．4．1 玉米基因组DNA提取

2．4．2 玉米PEAMT基因启动子克隆结果

2．4．3 PEAMT基因启动子的生物信息学分析

2．5 讨论

2．7 小结

第三章 PEAMT基因启动子全长序列活性验证

3．1 试验材料与试剂

3．2 试验方法

3．2．1 PEAMT基因启动子融合GUS基因表达载体构建

3．2．2 农杆菌介导的启动子融合表达载体在烟草中的瞬时表达分析

3．2．3 GUS活性检测

3．3 结果与分析

3．3．1 PEAMT基因启动于融合GUS报告基因表达载体的构建

3．3．2 组织化学染色法验证启动子活性

3．3．3 PEAMT基因启动子活性分析

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 PEAMT基因启动子缺失分析

4．1 材料与试剂

4．2 试验方法

4．2．1 引物设计

4．2．2 克隆载体的构建

4．2．3 表达载体的构建

4．2．4 烟草转化及转基因烟草中缺失启动子活性的研究

4．3 结果与分析

4．3．1 PEAMT基因启动子缺失片段载体构建

4．3．2 组织化学染色法鉴定启动子活性

4．3．3 不同非生物胁迫下PEAMT启动子缺失体活性变化

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

参考文献

缩略词

附录

致谢

作者简介