PTPN22 619 Arg＞Trp突变对糖尿病发生的影响和调控机理

摘要

PTPN22是一种非受体型蛋白酪氨酸激酶，主要表达于造血细胞和免疫细胞中，作用于配体蛋白的酪氨酸去磷酸化过程。PTPN22基因1858位点C至T的单核苷酸突变引起人体中第620位和小鼠中第619位编码氨基酸精氨酸(Arg)至色氨酸(Trp)的变异而这一多态性被证实与许多自身免疫性疾病相关，如Ⅰ型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和克罗恩病等。在T细胞中，PTPN22 Arg＞Trp多态性导致与下游配体基因，蛋白络氨酸激酶Csk的结合程度降低进三倍，进而影响T细胞受体信号通路。然而这一Arg到Trp的变异对于免疫细胞的形态、功能及糖尿病发生的影响还知之甚少。本研究以自主构建的PTPN22619Arg＞Trp基因敲入小鼠为实验对象，研究了这一变异对小鼠Ⅰ型及Ⅱ型糖尿病发生的影响及抗原呈递巨噬细胞、Treg、 Teff等免疫细胞的数目、形态及功能的变化，并通过细胞分泌因子、标志性蛋白和表面抗原的检测进行了具体的机理研究。本结果将对深入研究糖尿病、自身免疫疾病的发病机理提供重要的理论基础。
　　研究结果主要有:
　　1.巨噬细胞分化后形态受PTPN22619Arg＞Trp多态性影响。
　　(1)在BL6背景的PTPN22619Arg与Trp敲入鼠中，Trp敲入鼠的脾脏增大，但各种免疫细胞含量并没有变化。
　　(2)巨噬细胞在细胞因子的作用下分化为球形M1巨噬细胞，去分化后619Arg巨噬细胞重新恢复梭形而619Trp还是基本保持球形。(3)作为PTPN22配体，在细胞骨架重新构架中具有重要作用的VAV的去磷酸化程度在619Trp小鼠中减弱。
　　2.PTPN22619Arg＞Trp多态性影响巨噬细胞功能及分泌因子表达量。
　　(1)619Trp巨噬细胞比野生型巨噬细胞更能促进T细胞活性和增殖。(2)619Trp巨噬细胞具有更强的吞噬能力。(3)619Trp巨噬细胞表面表达更多的MHCⅡ，CD80和CD86。
　　3.巨噬细胞功能及分泌因子表达量变化不足以诱发突变敲入鼠发生Ⅱ型糖尿病。
　　(1)619TrpM1巨噬细胞抑制细胞因子，如IL-6，iNOS与TNFa的表达。
　　(2)与PTPN22619Trp巨噬细胞共培养的成熟脂肪细胞表达更多的GLUT1。
　　(3)高脂日粮饲喂下，BL6背景的PTPN22619Arg与Trp敲入鼠的体重，葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性无显著差异。
　　4.与人类发病相反，NOD小鼠中PTPN22619Trp对Ⅰ型糖尿病发生具有保护作用，其原因可能是由于PTPN22619Arg＞Trp多态性对于Treg的影响不同。
　　(1)NOD背景的PTPN22619Trp小鼠对自身免疫性疾病的抵抗力升高。
　　(2)Trp敲入鼠的Treg细胞数目增多但是对Teff细胞增殖的抑制功能较野生型小鼠减弱，且Trp敲入鼠的Teff细胞具有更高的增殖能力。(3)在体实验证明，在等量Treg注射的前提下，619Treg小鼠患糖尿病的几率大大增加，这与人体中的发现相同。综上所述，PTPN22619Arg＞Trp多态性可影响巨噬细胞的形态与功能，并进而影响T细胞的活性与增殖，从而引发一系列自身免疫性疾病。虽然突变的巨噬细胞由于分泌不同的细胞因子影响了脂肪细胞GLUT1的表达，但在体情况下并不引起体重、胰岛素敏感性等的变化。而PTPN22619Arg＞Trp多态性导致的Treg细胞数量与功能的变化可能是另一其引发自身免疫性疾病的原因。本研究揭示了PTPN22619Arg＞Trp多态性对于Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病发生的影响以及对于免疫系统内多种免疫细胞的作用，为糖尿病的发病机理研究提供了重要的参考意义。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 PTPN22与自身免疫疾病研究进展

1．1 自身免疫疾病

1．1．1 自身免疫疾病的类型及发病原因

1．1．2 Ⅰ型培尿病研究进展

1．1．3 自身免疫疾病对畜牧业的影响

1．2 PTPN22在自身免疫疾病中的作用

1．2．1 蛋白酪氨酸磷酸酶PTP和蛋白酪氨酸激酶PTK在免疫系统中的作用

1．2．2 PTPN22编码蛋白LYP的结构和变异位点

1．2．3 PTPN22与自身免疫性疾病相关性

1．2．4 PTPN22在淋巴细胞中的作用

1．2．5 PTPN22与抗原呈递细胞

1．3 抗原呈递细胞与T细胞

1．3．2 抗原呈递细胞与T细胞的相互作用

1．4 脂肪组织与免疫

1．4．1 脂肪组织及其功能

1．4．2 脂肪沉积和免疫的关系

前言

第二章 PTPN22 619Arg>Trp突变对免疫细胞数目与形态的影响

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验动物饲养与管理

2．2．2 免疫组织单细胞悬液的获取

2．2．3 MACS磁珠分选细胞

2．2．5 抗体刺激T细胞增殖

2．2．4 流式细胞术

2．2．6 巨噬细胞的分离培养及分化

2．2．7 免疫荧光

2．3．1 PTPN22 619Arg>Trp多态性对免疫细胞数目的影响

2．3．2 PTPN22 619Arg>Trp多态性改变巨噬细胞形态及原因

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 PTPN22 619Arg>Trp多态性影响巨噬细胞功能

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．4 巨噬细胞与T细胞共培养

3．2．5 巨噬细胞表面蛋白检测

3．2．6 巨噬细胞吞噬功能检测

3．2．7 ELASA

3．2．8 q-PCR

3．2．9 数据统计分析

3．3 结果与分析

3．3．1 PTPN22 619Arg>Trp多态性促进巨噬细胞对T细胞的刺激作用

3．3．2 PTPN22 619Arg>Trp多态性促进巨噬细胞的吞噬作用

3．3．3 PTPN22 619Arg>Trp多态性促进巨噬细胞表面MHCII／B7表达

3．3．4 PTPN22 619Arg>Trp多态性影响巨噬细胞细胞因子的表达

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 PTPN22 619Arg>Trp突变在Ⅱ型糖尿病中的作用

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验动物饲养与管理

4．2．2 M1／M2巨噬细胞的极化

4．2．3 脂肪细胞分离培养

4．2．4 巨噬细胞与脂肪细胞共培养

4．2．5 实时定量PCR

4．2．6 葡萄糖耐量分析和胰岛素敏感性分析

4．2．7 细胞流式分析

4．2．8 数据统计分析

4．3 结果与分析

4．3．1 活体水平下PTPN22 619Arg>Trp多态性对肥胖指标的影响

4．3．2 PTPN22619 Arg>Trp多态性对于脂肪组织内巨噬细胞群的作用

4．3．3 PTPN22 619Arg>Trp提高脂肪细胞稳态

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 小鼠中PTPN22 619 Arg>Trp多态性对Ⅰ型糖尿病发生的作用及可能的原因

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验动物饲养与管理

5．2．2 小鼠的糖尿病发生监测

5．2．4 Teff细胞增殖实验

5．2．5 Treg细胞功能分析

5．2．6 小鼠细胞过继实验

5．2．7 小鼠各组织Treg细胞数量检测

5．3．2 PTPN22 619Arg>Trp多态性对Treg和Teff细胞的影响

5．3．3 活体水平下验证619Trp Treg细胞对糖尿病发生的影响

5．4 讨论

5．5 小结

本研究主要结论、创新点与进一步研究内容

1．本研究的主要结论

2．创新点

3．进一步研究内容

缩略词

参考文献

附录

致谢

作者简介