小麦表皮蜡质二酮合成候选基因的筛选及功能鉴定

摘要

植物表皮蜡质位于植物的最外层，是隔绝植物与外界环境发生交换的屏障。表皮主要由超长链脂肪酸及其衍生物组成，在植物的生长发育过程中尤为重要，不仅可以有效地阻止植物的非气孔性水分散失、防止植物受到紫外损伤，还具有维持清洁、防止病虫害侵蚀等作用。中链烷烃羟基化酶(Midchain Alkane Hydroxylase，MAH1)是参与植物蜡质合成脱碳途径中的重要酶，主要负责催化脱碳途径中次级醇和酮的合成。小麦作为重要的粮食作物，其表皮蜡质主要由烷烃，初级醇、脂肪酸和脂肪醛组成，除此之外，还积累了丰富的二酮。本研究主要利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)、气相色谱离子化火焰检测器(GC-FID)对17个小麦品种穗部蜡质成分及含量进行分析以了解小麦蜡质的成分及组成特点，并以拟南芥AtMAH1序列为参考，在小麦数据库中搜索筛选同源性较高的序列，以小麦310为模板，克隆了8个小麦二酮合成基因TaMAH，并将基因转入番茄“Micro Tom”中，对转基因阳性植株叶片蜡质的成分及含量进行分析以验证TaMAH功能，结果如下:
　　1.通过对于17个小麦品种（系）材料穗部蜡质成分及含量的分析，发现不同蜡质表型的小麦品种（系）穗部蜡质成分相同，但蜡质总量及各组分含量存在差异，白霜状小麦穗部蜡质总含量高于嫩绿小麦（中国春），其中白霜状小麦穗部蜡质中β-二酮为主要成分，约占分离出总物质的70.68％-88.29％，中国春穗部则以二酮和烷烃为主要成分，分别占38.36％和38.14％。β-二酮的衍生产物羟基-β-二酮仅存在于白霜状小麦品种蜡质中，在中国春穗部蜡质中并未被检测到。
　　2.利用同源比对从小麦数据库中筛选了同源性较高的45个基因，通过一系列生物信息学分析，从45个小麦二酮合成候选基因中选取了10个较为可靠的基因，命名为TaMAH1-TaMAH10，基因序列长度约为1300bp-1500bp。通过进化分析发现，TaMAH2与TaMAH5所编码的蛋白一致，TaMAH1、TaMAH2、TaMAH3、TaMAH4、TaMAH5和TaMAH9与AtMAH1亲缘关系较近，而TaMAH6、TaMAH7、TaMAH8和TaMAH9则与AtMAH1亲缘关系较远，最终成功克隆基因8个基因并完成植物表达载体的构建。
　　3.利用农杆菌介导法将8个小麦TaMAH基因导入番茄“Micro Tom”中，利用PCR筛选转基因阳性植株，最终获得54棵转基因阳性植株。对阳性植株叶片蜡质进行分析发现，与对照相比，转基因阳性株系叶片蜡质成分并未发生改变，TaMAH1B、TaMAH3阳性株系蜡质总含量明显增加，蜡质组分中烷烃、脂肪醇、脂肪酸均有不同程度增加，其中以脂肪醇变化最为明显，其碳链长度分布也发生变化，在阳性植株叶片蜡质中检测到奇数碳原子醇并且奇数醇含量远高于对照组，脂肪醇中C26∶0-OH、C27∶0-OH、C29∶0-OH、C31∶0-OH含量增加明显，蜡质组分中萜类化合物含量并未发生变化。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 植物表皮蜡质的概述

1．1．1 植物表皮蜡质的形态结构与组成

1．1．2 植物表皮蜡质的功能

1．1．3 植物表皮蜡质的生物合成

1．2 植物表皮蜡质相关基因研究进展

1．2．1 蜡质合成基因研究进展

1．2．2 蜡质调控基因的研究进展

1．3．小麦蜡质研究进展

1．4 本研究目的及意义

第二章 不同小麦品种穗部表皮蜡质的成分及含量分析

2．1 材料与试剂

2．1．1 材料

2．1．2 试剂

2．2 试验方法

2．2．1 样品制备

2．2．2 蜡质成分分析

2．3 结果与分析

2．3．1 小麦穗部表皮蜡质的化学成分及含量

2．3．2 小麦穗部表皮蜡质组分的碳链分布情况

2．3．3 不同小麦品种穗表皮蜡质成分及含量的比较

2．4 讨论

第三章 小麦表皮蜡质二酮合成候选基因的筛选及功能鉴定

3．1 试验材料

3．1．1 植物材料、菌株和载体

3．1．2 试验试剂

3．2 小麦二酮合成候选基因的筛选及功能鉴定

3．2．1 小麦二酮合成候选基因的筛选

3．2．2 小麦二酮合成候选基因的克隆及植物表达载体的构建

3．2．3 农杆菌介导番茄遗传转化

3．2．4 番茄转基因阳性植株的PCR鉴定

3．2．5 转基因阳性植株叶片蜡质检测

3．3 结果与分析

3．3．1 小麦二酮合成候选基因的筛选

3．3．2 小麦二酮合成候选基因的克隆及植物表达载体的构建

3．3．3 农杆菌介导番茄转化

3．3．4 转基因阳性植株筛选鉴定

3．3．5 转基因阳性植株叶表皮蜡质的检测

3．4 讨论与结论

3．4．1 讨论

3．4．2 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介