小鼠卵母细胞玻璃化冷冻对DNA损伤和印记基因H19和Gt12表达及DNA甲基化的影响

摘要

卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻技术是辅助生殖技术的重要组成部分，其广泛应用于优良家畜、珍稀和濒危动物的保种和人类不孕不育症的治疗等领域。随着科研人员的不断努力，玻璃化冷冻技术日趋成熟，应用也越来越普遍。但是，近年来的研究发现，玻璃化冷冻不仅对其细胞超微结构以及细胞膜等造成不良影响，还对其卵母细胞或者胚胎DNA甲基化水平、发育基因的表达、DNA损伤和印记基因等产生影响，对胚胎发育以及后代存在潜在风险。本研究使用卵母细胞单细胞凝胶电泳、免疫荧光染色、qRT-PCR和TUNEL染色等方法，分析了卵母细胞玻璃化冷冻对MⅡ期卵母细胞及胚胎DNA损伤的影响;同时使用qRT-PCR和亚硫酸氢盐测序法，检测了卵母细胞玻璃化冷冻对MⅡ期卵母细胞及受精后代印记基因H19和Gtl2差异甲基化区域(DMRs) DNA甲基化状态及表达的影响。获得了如下研究结果:
　　1、卵母细胞单细胞凝胶电泳实验研究表明，冷冻组和对照组的尾部DNA和OTM值差异不显著;免疫荧光染色显示，冷冻组和对照组MⅡ期卵母细胞中γ H2AX水平差异不显著，而5hmC水平显著升高;冷冻卵母细胞激活发育到2-cell，冷冻组的γ H2AX位点数与对照组比较显著升高(P＜0.05)，5hmC水平也显著升高(P＜0.05);在MⅡ期卵母细胞中，53BP1、Casp3、Fas、Gadd45a和Ddit3中表达水平差异不显著;在2-cell中，Casp3和Fas的表达水平变化差异不显著，53BP1、Gadd45a和Ddit3表达水平显著升高(P＜0.05);冷冻组卵母细胞孤雌激活后卵裂率和囊胚率显著降低(P＜0.05)，囊胚凋亡细胞数显著上升(P＜0.05)。
　　2、在MⅡ期卵母细胞中，冷冻组和对照组的H19甲基化状态没有显著差异(P＞0.05)，冷冻组Gtl2差异甲基化区域的平均甲基化水平(5.83％)显著低于对照组(9.22％)(P＜0.05);冷冻后卵母细胞印记基因H19的表达水平无显著变化(P＞0.05)，而GTl2表达水平显著下降;在冷冻卵母细胞体外受精和胚胎移植后，对获得的性成熟仔鼠的心脏、脾脏、肺脏和肾脏进行检测，发现Gtl2差异甲基化区域DNA甲基化水平与对照差异不显著(P＞0.05)，肝脏检测发现，冷冻组Gtl2差异甲基化区域DNA甲基化水平显著高于对照组(P＜0.05);实时定量的结果显示，在脾脏和肾脏中Gtl2表达水平变化不明显(P＞0.05)，心脏、肝脏和肺脏中Gtl2表达水平显著上升(P＜0.05)。
　　结论:MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻-解冻后，未检测到明显的DNA损伤，但是冷冻卵母细胞发育到2-cell期，可以检测到DNA损伤的发生，并且检测发现53BP1、Gadd45a和Ddit3表达上调。卵母细胞玻璃化冷冻后早期胚胎发育卵裂率和囊胚率降低，囊胚凋亡细胞数上升。卵母细胞玻璃化冷冻会影响MⅡ期卵母细胞印记基因Gtl2的表达和差异甲基化区域DNA甲基化水平，也会对获得的仔鼠器官中印记基因Gtl2的表达和差异甲基化区域DNA甲基化水平造成影响。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 卵母细胞和胚胎的玻璃化冷冻

1．1 玻璃化冷冻的定义及历史

1．1．1 玻璃化冷冻的定义

1．1．3 玻璃化冷冻的历史

1．2 卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻的发展

1．2．1 开放式拉长麦管法(Open pulled straw，OPS)

1．2．2 封闭式拉长麦管法(Closed pulled straw，CPS)

1．2．4 半麦管法(Hemi-straw)

1．2．5 Cryotop法

1．2．6 CryoTip法

1．2．7 微滴法

1．2．9 Cryotech法

1．3 玻璃化冷冻保护剂

1．3．1 冷冻保护剂的发展

1．3．2 冷冻保护剂的分类

1．4 玻璃化冷冻安全性

第二章 DNA损伤

2．1 基因组完整性的重要性

2．2 不同性质的DNA损伤及其来源

2．2．1 内源性损伤来源

2．2．2 环境中的辐射

2．2．3 抗肿瘤药物

2．3 DNA损伤应答反应

2．3．1 DNA双链断裂的监督和信号传递

2．4 DNA损伤应答反应引起的细胞活动

2．4．1 细胞周期停滞和衰老

2．4．2 细胞凋亡

2．5 DNA损伤修复机制

2．5．1 直接修复

2．5．2 碱基切除修复(BER)

2．5．3 核苷酸切除修复(NER)

2．5．4 错配修复(MMR)

2．5．5 链断裂修复

2．6 DNA损伤应答反应破坏和基因组完整性受损的后果

2．6．1 与DNA受损应答反应缺陷相关的疾病

2．6．2 DNA损伤修复缺陷和致瘤性转化

2．6．3 衰老

第三章 卵母细胞玻璃化冷冻对DNA损伤的影响

3．1 实验材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 主要仪器设备

3．1．3 主要试剂和药品

3．2 实验方法

3．2．1 卵母细胞的采集

3．2．2 MII期卵母细胞的冷冻和解冻

3．2．3 卵母细胞的孤雌激活和胚胎培养

3．2．4 彗星实验

3．2．5 卵母细胞和孤雌胚胎的免疫荧光染色

3．2．6 免疫荧光染色图片分析

3．2．7 孤雌囊胚凋亡染色

3．2．8 孤雌囊胚细胞计数

3．2．9 卵母细胞及孤雌胚胎的qRT-PCR检测

3．2．10 数据统计分析

3．3 实验结果

3．3．1 MII期卵母细胞彗星实验结果

3．3．2 卵母细胞玻璃化冷冻对DNA损伤相关基因表达的影响

3．3．3 卵母细胞玻璃冷冻对5hmC和vH2AX的影响

3．3．4 卵母细胞玻璃化冷冻对孤雌囊胚凋亡的影响

3．3．5 卵母细胞玻璃冷冻对孤雌胚胎发育的影响

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 卵母细胞玻璃化冷冻对印记基因DNA甲基化的影响

4．1 实验材料

4．1．1 实验动物

4．1．2 主要仪器设备

4．1．3 主要试剂和药品

4．2 实验方法

4．2．1 卵母细胞的采集

4．2．3 体外受精(IVF)和胚胎培养

4．2．4 胚胎移植

4．2．5 出生后小鼠各器官采集、基因组DNA提取和RNA提取

4．2．6 定量引物设计

4．2．7 卵母细胞的qRT-PCR检测

4．2．8 亚硫酸氢盐测序法

4．2．9 数据统计分析

4．3 实验结果

4．3．2 玻璃化冷冻对MII期卵母细胞印记基因DNA甲基化的影响

4．3．3 卵母细胞玻璃化冷冻对其后代器官中印记基因表达的影响

4．3．4 卵母细胞玻璃化冷冻对其后代器官中印记基因DNA甲基化的影响

4．4 讨论

4．5 小结

全文结论

创新点和后续研究工作

缩略词表

参考文献

致谢

作者简介