猪多能干细胞中LAMININ基因表达谱的分析及其可变剪切体的分子克隆

摘要

层粘连蛋白(Laminin，LN)是细胞膜的重要成分，采用LN作为细胞基质培养多能干细胞，可以维持干细胞的自我更新和多能性。LN家族中有15种不同的亚型，每一种亚型由三条肽链(α、β、γ)组成，形成十字架结构的异源三聚体。其中LamininA5(LAMA5)对于维持多能干细胞的生长有重要作用。本研究旨在检测猪不同组织和细胞中LAMININ的表达情况，研究LN在多能干细胞分化过程中的时空表达特性;通过生物信息学分析和分子克隆，确认猪LAMA5基因的存在和表达变化;发现并分子克隆了与猪多能干细胞特性相关的Laminin B1-a(LAMB1-a)可变剪接体。本研究丰富了对猪多能干细胞培养基质研究的信息，为研究猪干细胞多能性的维持提供了理论依据。
　　本研究获得的主要结果如下:
　　1.LAMININ在猪组织和细胞中的表达谱分析
　　用RT-PCR检测猪不同组织（肝脏、心脏、肺、胃、脑、睾丸、脂肪、颗粒细胞组织）、体细胞（肝细胞、脂肪细胞、猪胎儿成纤维细胞）和多能干细胞(DOX-iPS、PS11、PS23)中LAMININ不同亚型的表达情况。结果表明，不同组织和细胞中LAMININ的表达存在明显差异。通过比对组织来源和细胞来源的样品发现，在细胞中LAMININ的表达特异性更加突出，其中在PEF细胞中LAMININ的表达特征为:LAMA45-LAMB1/2-LAMC1/2（即LN-411、 LN-421、LN-511和LN-521）;在猪iPS细胞中LAMININ的表达特征为:LAMA15-LAMB1-a/2-LAMC1(即LN-11a1、LN-121、LN-51a1和LN-521)。
　　2.猪LAMA5的生物学分析和克隆
　　未注释有猪LAMA5基因的序列信息和相关报道。为此我们运用NCBI和UCSC等数据库，分析人、牛和山羊的LAMA5基因序列，预测猪LAMA5基因，以RPS21和CABLES2基因对猪基因组数据库(Sscrofa11.1)中LAMA5的可能序列区域进行定位。通过DNAMAN(V6)软件进行比对，确认了猪LAMA5的序列，并设计特异性引物，从猪肺组织样cDNA中克隆了长度为731 bp的猪LAMA5基因序列。测序结果与人和牛LAMA5序列高度一致，序列上传至GENBANK，获得登录号:KY622023。
　　3.猪多能干细胞中LAMININ的表达特性和LAMB1-a可变剪接体的发现
　　通过检测，发现猪iPS细胞中，LAMB1出现了两条特异性条带，为了进一步研究LAMB1的性质，对克隆的两条特异性条带（LAMB1505bp、LAMB1-a639bp）进行测序，结果显示与NCBI中已有的LAMB1-X1和LAMB1-X2序列不一样，发现LAMB1-a是一个新的可变剪接体。
　　为了进一步探讨LAMB1与多能干细胞的相关性，选取猪PEF和猪多能干细胞DOX-iPS及分化的iPS细胞进行了检测。结果显示，随着多能干细胞形态的改变，细胞团形态逐渐消失，LAMB1-a的表达逐渐下降，当再次运用DOX-iPS培养基培养后，当细胞团形态再次恢复的时候，LAMB1-a的表达逐渐恢复。
　　在检测中还发现，在iPS重编程过程中LAMA4的表达随着细胞的分化程度，其表达量明显升高，相反在细胞分化的过程中LAMA1的表达量逐渐降低。
　　总之，本研究确定了猪多能干细胞中LAMININ的表达特征，即LN11a1/LN121和LN51a1/LN521;确认了猪LAMA5基因的存在，并分析和克隆了该基因;发现了LAMB1-a可变剪接体，并验证了该基因与多能干细胞的对应关系。

目录

声明

摘要

第一章 细胞外基质与干细胞培养

1．1 细胞外基质的组成和制备

1．1．1 细胞外基质的组成

1．1．2 细胞外基质的制备

1．2 细胞外基质的生物学功能

1．3 细胞外基质与干细胞多能性的关系

第二章 层粘连蛋白(LAMININ)的结构与功能

2．1 LN的结构和表达

2．1．1 LN的结构

2．1．2 LN的表达

2．2 LN生物学功能

2．2．1 LN调节细胞生命活动

2．2．2 LN与整合素相互作用

2．2．3 Laminin A5支持干细胞的增殖

2．3 LN与疾病的关系

第三章 猪LAMININ基因家族表达谱分析

3．1 材料和方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果

3．2．1 猪LAMININ转录组数据的生物信息学分析

3．2．2 猪LAMININ在组织和细胞中的表达谱

3．2．3 猪LAMININ蛋白在细胞中的表达情况

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 LAMININ A5基因的克隆和鉴定

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果

4．2．1 猪LAMA5基因序列的预测、鉴定和同源分析

4．2．2 猪LAMA5基因的克隆和鉴定分析

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 猪多能干细胞中LAMININ的表达特性和LAMB1-a可变剪接体的发现

5．1 材料和方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．2 结果

5．2．1 猪LAMININI基因在干细胞中的表达

5．2．2 LAMB1可变剪切体的克隆

5．3 讨论

5．4 小结

总结

本研究的创新点与进一步研究的课题

参考文献

附录

英文缩略词表

致谢

作者简介