微丝骨架Actin介导的拟南芥免疫反应及其抗小麦条锈病机制研究

摘要

微丝骨架作为真核细胞中动态变化的三维网状结构，在植物感知和抵抗病原菌侵染中发挥重要作用。微丝骨架参与植物的免疫反应，但其如何参与免疫信号传导过程，目前所知甚少。小麦条锈病是由条形柄锈菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici）引起的小麦生产上危害严重的一种真菌病害，但是小麦抗条锈病机制研究尚不完全清楚。因此，从模式植物拟南芥以及小麦重要病害条锈病入手，研究微丝骨架actin（肌动蛋白）介导的植物免疫机制，对全面了解微丝骨架参与拟南芥免疫机制，以及进一步阐明小麦与条锈菌互作的分子机理，具有重要意义。
　　本研究以拟南芥和小麦作为研究对象，主要通过微丝骨架荧光标记、酵母双杂交、免疫共沉淀、蛋白磷酸化、病毒诱导基因沉默、LC/MS(liquid chromatography/massspectrometry，液相色谱/质谱)技术和MAPK（mitogen-activated protein kinase，丝裂原活化蛋白激酶）等实验技术和方法，筛选与微丝骨架肌动蛋白ACT7互作蛋白，对拟南芥微丝骨架肌动蛋白ACT7、肌动蛋白结合蛋白CAP1和小麦肌动蛋白解聚因子ADF4的功能进行了深入研究。主要研究结果如下:
　　1.对拟南芥cDNA文库进行筛选，选出24个与ACT7互作的蛋白，其中包括actin结合蛋白ADF1、ADF4和ARPC3等，与植物免疫相关的RIN4、ROC4、LOS2蛋白，以及CAP1等多个目前在植物免疫中功能尚不清楚的蛋白。利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术，进一步验证了ACT7与RIN4、CAP1的蛋白相互作用。
　　2.利用拟南芥-丁香假单胞菌模式互作系统，发现ACT7和CAP1参与DC3000和DC3000AvrRpm1引起的拟南芥免疫反应，ACT7负调控拟南芥抗病性，CAP1正调控拟南芥抗病性。与野生型Col-0相比，act7-2突变体抑制DC3000繁殖，相反cap1突变体促进DC3000大量繁殖。cap1突变体产生严重坏死斑，act7-2突变体几乎无坏死斑产生。与野生型Col-0相比，act7-2突变体抑制DC3000AvrRpm1生长，坏死面积降低，表现更为抗病;cap1突变体促进DC3000AvrRpm1生长，抑制HR反应，坏死面积增加，表现更为感病。
　　3.利用flg22诱导的MAPK实验，证明突变CAP1显著抑制flg22诱导的MAPK3/MAPK6的积累，而突变ACT7促进flg22诱导的MAPK3/MAPK6的积累。与对照相比，flg22处理后10 min，cap1突变体中MAPK3/MAPK6积累量显著降低;act7-2中MAPK3/MAPK6积累量升高。qRT-PCR检测发现，PTI信号途径marker基因FRK1在act7-2突变体中显著上调表达;在cap1突变体中显著抑制表达。表明ACT7和CAP1参与flg22诱导的MAPK信号级联反应PTI途径。
　　4.采用Phos-tag技术对DC3000AvrRpm1诱导RIN4在act7-2和cap1突变体中磷酸化情况进行分析，发现与野生型相比，ACT7突变后，RIN4磷酸化被促进并增强，而RIN4磷酸化在CAP1突变后受到抑制。接种病原菌DC3000AvrRpm1后，act7-2中RIN4积累量显著降低，而cap1中RIN4的积累却未降低。qRT-PCR分析显示，ETI免疫相关基因RPM1、PR1以及WRKY70在ACT7突变后表达量升高，在CAP1突变后表达量显著降低。表明ACT7和CAP1参与RIN4介导的拟南芥ETI免疫信号途径。
　　5.从小麦cDNA文库中，克隆了6个小麦ADF基因，分别命名为TaADF3、TaADF4、TaADF5、TaADF6、TaADF8和TaADF11。酵母双杂交及免疫共沉淀结果，证明TaADF4与TaACT1、AtADF4与AtACT7直接互作，同时TaADF4与AtACT7、AtADF4与TaACT1交叉互作。蛋白三维结构建模，TaADF4与AtADF4蛋白模型几乎完全重合，表明TaADF4和AtADF4结构功能相似。小麦ADFs与TaACT1特异性互作分析显示，TaADF8不与TaACT1互作，且TaADF8蛋白结构模型独立于另外5个小麦ADF蛋白结构模型，表明不同的小麦ADFs可能存在功能特异性。激光共聚焦显微观察，发现TaADF4-RFP与TaACT1-GFP荧光标记蛋白信号共定位于微丝骨架。蛋白磷酸化实验，证明AtADF4和TaADF4活性被CPK3磷酸化调节。
　　6.qRT-PCR分析显示，TaADF4参与小麦生物与非生物应答，TaADF4被高温、茉莉酸甲酯和脱落酸诱导上调表达，盐和低温显著抑制其表达。TaADF4在小麦与条锈菌CYR23非亲和互作中表达量显著高于小麦与条锈菌CYR31亲和互作。利用VIGS技术沉默TaADF4后，小麦对条锈菌CYR23的抗性降低。LatB处理微丝骨架诱导TaADF4上调表达，抑制条锈菌菌丝生长，促进活性氧的积累和过敏性坏死。利用LC/MS技术，对植物激素JA(jasmonic acid茉莉酸)和SA（salicylic acid水杨酸）的积累进行检测，结果显示TaADF4沉默后，JA的积累量较对照组明显降低。以上结果证明，TaADF4通过参与小麦JA信号途径转导，积极调节小麦对条锈菌小种CYR23的抗性作用。
　　综上所述，本研究进一步解析了微丝骨架在植物免疫过程中的重要作用，首次发现并证明了微丝骨架肌动蛋白ACT7和环化酶相关蛋白CAP1，参与flg22诱导的MAPK拟南PTI信号途径和RIN4介导的ETI信号传导途径，最后探索了小麦肌动蛋白解聚因子TaADF4在小麦抵抗条锈病侵染过程中的作用，为全面了解植物的病害分子机制提供了理论依据。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 植物免疫机制研究进展

1．1．1 植物免疫途径

1．1．2 拟南芥免疫机制

1．1．3 小麦抗条锈病研究进展

1．2 微丝骨架

1．2．1 微丝骨架及肌动蛋白结合蛋白

1．2．2 微丝骨架Actin参与植物免疫过程

1．3 Actin功能研究进展

1．4 CAP功能研究进展

1．5 RIN4参与的植物免疫机制研究

1．6 ADF功能研究进展

1．7 本研究的目的和意义

第二章 拟南芥ACT7互作蛋白的筛选及鉴定

2．1 引言

2．2 试验材料与试剂

2．2．1 材料

2．2．2 载体

2．2．3 试剂

2．3 试验方法

2．3．1 诱饵ACT7重组质粒构建与酵母菌转化

2．3．2 酵母蛋白提取及ACT7蛋白表达检测

2．3．3 ACT7自激活LexA系统能力检测

2．3．4 文库cDNA转化酵母及阳性克隆筛选

2．3．5 酵母阳性克隆质粒提取与测序

2．3．6 感兴趣互作酵母双杂交验证

2．3．7 免疫共沉淀蛋白互作验证

2．3．8 Western blot蛋白检测

2．4 结果与分析

2．4．1 酵母蛋白提取及ACT7蛋白表达检测

2．4．2 ACT7自身激活LexA系统能力检测

2．4．3 ACT7互作蛋白初步筛选

2．4．4 ACT7与CAP1相互作用

2．4．5 ACT7与RIN4相互作用

2．4．6 ACT7、CAP1与RIN4蛋白互作

2．5 讨论

第三章 拟南芥ACT7和CAP1在免疫过程中的功能研究

3．1 引言

3．2 试验材料与试剂

3．2．1 试验材料

3．2．2 试验试剂

3．3 试验方法

3．3．1 ACT7和CAP1拟南芥突变体纯合子的筛选与鉴定

3．3．2 ACT7和CAP1拟南芥突变体纯合子基因沉默效率检测

3．3．3 ACT7和CAP1纯合突变体接种病原细菌及病害表型鉴定

3．3．4 act7-2和cap1突变体的HR反应

3．3．6 AvrRpm1诱导RIN4蛋白在act7-2和cap1突变体中积累检测

3．3．7 AvrRpm1诱导RIN4蛋自在act7-2和cap1突变体中磷酸化检测

3．3．8 免疫相关基因在act7-2和cap1突变体中的表达检测

3．4 结果与分析

3．4．1 ACT7和CAP1拟南芥纯合突变体筛选与鉴定

3．4．2 ACT7和CAP1对病原细菌生长的影响

3．4．3 CAP1促进AvrRpm1诱发的拟南芥HR反应

3．4．4 ACT7和CAP1参与fig22诱导的MAPK信号途径

3．4．5 RIN4蛋白在act7-2和cap1突变体中的积累与磷酸化

3．4．6 ACT7和CAP1参与SA和JA信号传导

3．5 讨论

第四章 小麦ADF4在小麦与条锈菌互作中的作用研究

4．1 引言

4．2 试验材料与试剂

4．2．1 试验菌株及植物材料

4．2．2 载体

4．2．3 试剂

4．3 试验方法

4．3．1 TaADFs和TaACT1基因克隆与测序

4．3．2 TaADF4功能结构域，进化关系分析及ADFs蛋白三维结构模型建立

4．3．3 ADFs与actin酵母双杂交实验

4．3．4 ADFs与actin免疫共沉淀实验

4．3．5 TaADF4与TaACT1荧光标记及微丝骨架激光共聚焦观察

4．3．6 CPK3磷酸化TaADF4实验

4．3．7 TaADF4组织分布及生物胁迫与非生物胁迫诱导表达检测

4．3．8 微丝解聚处理及条锈菌接种

4．3．9 组织学观察

4．3．10 VIGS诱导的TaADF4基因沉默及病害表型鉴定

4．3．11 液相串联质谱对SA和JA大分子积累检测

4．4 结果与分析

4．4．1 小麦ADFs基因克隆

4．4．2 TaADF4序列、结构功能域及进化关系分析

4．4．3 ADFs与actins蛋白相互作用

4．4．4 TaADFs与TaACT1特异性互作

4．4．5 TaADF4与TaACT1共定位于微丝骨架

4．4．6 CPK3磷酸化ADF4

4．4．7 TaADF4表达模式及非生物胁迫表达分析

4．4．8 MeJA和条锈菌CYR23诱导TaADF4上调表达

4．4．9 TaADF4积极调控小麦抵抗条锈菌侵染过程

4．4．10 TaADF4促进JA积累

4．4．11 微丝骨架解聚条锈菌侵染的组织学分析

4．5 讨论

第五章 结论与创新点

5．1 结论

5．2 创新点

参考文献

附录

致谢

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