泰国伯克霍尔德氏菌Ⅵ型分泌系统基于锌离子转运的抗氧胁迫功能研究

摘要

锌参与许多细菌蛋白结构形成和催化过程，其对生命体的生长和发育必不可少。在病原菌感染脊椎动物的过程中，病原菌时常面临锌不足问题。为了获得足够的锌用以生存和感染，细菌已进化出了一系列有效锌转运系统。本研究中，我们以泰国伯克霍尔德氏菌（Burkholderia thailandensis）为实验对象，研究泰国伯克霍尔德氏菌中的第四套六型分泌系统(T6SS-4)在锌离子输入过程中的作用，并对T6SS-4参与的锌离子输入过程进行阐释。具体研究结果如下:
　　1.分析T6SS-4启动子区域的锌离子应答调控蛋白Zur结合位点的基础上，通过凝胶阻滞迁移实验(EMSA)证明Zur可以直接与T6SS-4基因簇启动子Zur-Box结合。qRT-PCR检测野生型菌株、zur缺失突变株中T6SS-4基因(icmF4，clpV4，hcp4)和tseZ基因的表达水平，结果表明Zur抑制T6SS-4基因簇的表达。但CHP氧化胁迫能解除Zur对T6SS-4基因和tseZ基因的抑制作用。
　　2.通过构建T6SS-4核心基因（clpV4、hcp4、icmF4）和tseZ基因突变株，比较野生型与突变株在氧胁迫下的存活率差异，发现T6SS-4各突变体和tseZ基因突变株在氧化胁迫下存活率较野生型显著降低。并且通过HPF探针检测不同菌株在氧化胁迫条件下胞内羟基自由基含量，发现T6SS-4突变菌株和tseZ基因突变株在氧化胁迫下胞内羟基自由基含量均明显高于野生菌株。证明T6SS-4基因和tseZ基因在抗氧化胁迫过程中起重要作用。
　　3.外源Zn2+能提高野生型细菌在氧化胁迫条件下的存活率，而缺失clpV4后外源Zn2+对细菌氧化胁迫条件下存活率的影响被削弱。同时使用ICP-MS测定了在H2O2、CHP胁迫下的胞内锌离子含量，发现缺失clpV4基因使胞内的Zn2+含量显著降低。在互补clpV4基因后，胞内Zn2+含量也回升到了与野生型相近的水平。证明氧化胁迫条件下，T6SS-4参于了Zn2+输入。
　　4.蛋白分泌检测发现TseZ蛋白的分泌依赖于T6SS-4。TseZ蛋白可与Zn2+特异性结合，并且在氧化胁迫条件下参与Zn2+输入。外源添加的TseZ蛋白能够提高野生型细菌和clpV4缺失突变株在氧化胁迫条件下的存活率，说明T6SS-4主要负责TseZ的分泌，一旦TseZ分泌出去后，其介导的锌离子从胞外到胞内的运输就不依赖于T6SS-4。
　　综上所述:本研究发现泰国伯克霍尔德氏菌在氧化胁迫条件下，解除了Zur对T6SS-4的抑制，高表达T6SS-4将TseZ蛋白分泌至胞外，通过TseZ蛋白捕获胞外Zn2+以减少氧化胁迫所产生的羟基自由基对细胞的损伤。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 细菌中锌离子的动态平衡

1．1．1 锌离子的生物学功能

1．1．2 细菌维持胞内锌离子平衡的策略

1．2 细菌Ⅵ型分泌系统

1．2．1 细菌Ⅵ型分泌系统的结构

1．2．2 细菌Ⅵ型分泌系统的功能

1．2．3 细菌Ⅵ型分泌系统的调控

1．3 泰国伯克霍尔德氏菌T6SS研究

1．4 研究目的和意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种与质粒

2．1．2 试验试剂与培养基

2．2 实验方法

2．2．1 细菌培养方法

2．2．2 敲除质粒及突变体构建

2．2．3 互补质粒及互补菌株构建

2．2．4 表达质粒构建

2．2．5 重组蛋白的过表达和纯化

2．2．6 蛋白分泌实验

2．2．7 细菌存活率实验

2．2．8 荧光染料检测细胞内活性氧

2．2．9 细胞内离子含量的测量

2．2．10 不含金属的apo-TseZ蛋白制备及离子结合分析

2．2．11 Western blot

2．2．11 凝胶迁移实验(EMSA)

2．2．12 实时定量PCR

第三章 实验结果

3．1 Zur对B．thailandensis T6SS-4的调控作用

3．2 T6SS-4参与抗氧化胁迫过程

3．3 T6SS-4是通过参与锌转运从而抗氧化胁迫

3．4 T6SS-4分泌一种可与锌离子结合的效应蛋白

3．5 氧胁迫条件下T6SS-4分泌TseZ蛋白以摄取Zn2+

第四章 分析与讨论

参考文献

附录

致谢

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