基于小反刍兽疫病毒疫苗株N蛋白的抗体检测间接ELISA方法的建立及初步应用

摘要

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种严重危害小反刍动物的急性、热性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将PPR列为需要通报的动物传染病，危害性极大，发病动物死亡率为100％，并且目前对于该病没有切实可靠的治疗措施，因此对于PPR的防控至关重要。对本病的的防控最常用和经济的方法是疫苗免疫接种，对免疫效果检测常通过检测免疫抗体水平来评价，酶联免疫吸附试验(ELISA)是监测抗体水平简单有效的方法，但目前国内市场用于有效检测PPRV抗体水平的试剂盒还是比较缺乏，并且大多数为进口试剂盒，虽然检测效果较为可靠，但其成本高，限制了其在防控PPR中的应用，需要研发PPR抗体检测试剂盒，用于临床检测。N蛋白为PPRV的核衣壳蛋白，其生物学功能多、保守性强，是PPRV中特异性最高、含量最丰富以及免疫原性最强的结构蛋白，是研制PPR抗体检测试剂盒的首选蛋白。
　　本研究从PPR疫苗毒中克隆获得PPRV N蛋白全基因，原核表达和鉴定后，收集目的蛋白并进行复性。以复性后的N蛋白作为包被抗原，建立检测PPR免疫抗体的间接ELISA方法并进行初步应用。研究获以下结果:
　　1.PPRV疫苗株N蛋白的基因克隆和原核表达:从PPR疫苗毒中通过RT-PCR克隆N基因全序列，基因长度为1578bp，将目的基因连接至pET-28a载体，构建重组原核表达质粒pET-28a-N。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21，筛选获得重组表达菌pET-28a-N/BL21。诱导表达的最佳条件为:IPTG1.0mmol/L，诱导7h。表达的蛋白主要以包涵体形式存在，蛋白的大小约为58ku。Western-blot检测表明，复性后的N蛋白具有良好的特异性和反应性。
　　2.PPR抗体检测间接ELISA方法的建立和初步应用:以纯化复性后N蛋白为包被抗原，建立检测PPRV抗体的间接ELISA方法。抗原每孔包被400ng，阳性血清和待检血清做1∶200倍稀释，每孔加入100μL，37℃作用2h，酶标二抗以1∶8000倍稀释，每孔加入100μL，37℃作用1h，TMB显色时间为20min，该间接ELISA的临界值为0.309;特异性和敏感性均良好;重复性试验表明，批内和批间OD450值的变异系数分别在2.29％～8.65％和2.13％～5.68％;用本试验建立的体系对临床上197份山羊血清进行检测，PPR抗体阳性率为85.79％，与标准试剂盒的符合率为96.4％。

目录

论文说明

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摘要

第一章 小反刍兽疫概述

1．1 小反刍兽疫的流行特点及其危害

1．2 小反刍兽疫病毒

1．2．1 病毒基因组结构

1．2．2 遗传特性

1．2．3 理化特性

1．3 小反刍兽疫诊断

1．3．1 临床诊断

1．3．2 病理学诊断

1．3．3 实验室诊断

1．4 小反刍兽疫疫苗

1．4．1 PPR异源弱毒疫苗

1．4．2 PPR同源弱毒疫苗

1．4．3 基因疫苗

1．5 小反刍兽疫的防控

1．5．1 保护易感动物免受感染

1．5．2 控制传染源

1．5．3 切断传播途径

1．5．4 PPR的监测及扑灭措施

1．6 研究目的意义

第二章 小反刍兽疫病毒疫苗株N基因的克隆、原核表达及纯化

2．1 材料

2．1．1 病毒毒株、菌株和质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 阳性血清

2．2 方法

2．2．1 引物的设计与合成

2．2．2 PPRV基因组RNA的提取及反转录

2．2．3 N基因的扩增及表达载体的构建

2．2．4 重组N蛋白的表达和表达条件的优化

2．2．5 重组N蛋白表达形式的确定及纯化和复性

2．3．2 pET-28a-N重组质粒的鉴定

2．3．3 重组蛋白的诱导表达及其表达条件的优化

2．3．4 重组N蛋白表达形式分析及纯化

2．3．5 重组N蛋白的Western blot分析

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 小反刍兽疫病毒N蛋白抗体检测间接ELISA方法的建立与应用

3．1 材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 血清

3．2．1 间接ELISA方法的建立

3．2．2 抗原、血清和酶标二抗最佳稀释浓度的确定

3．2．3 作用时间的优化

3．2．4 阴／阳性标准临界值的确定

3．2．5 特异性试验

3．2．6 敏感性试验

3．2．7 重复性试验

3．2．8 临床样品检测

3．3 结果

3．3．1 抗原包被量及血清和酶标二抗最佳稀释度的确定

3．3．2 作用时间的优化

3．3．3 阴／阳性标准临界值的确定

3．3．4 间接ELISA的特异性、敏感性和重复性

3．3．5 临床样品检测

3．4 讨论

3．5 小结

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介