拟南芥NO3-信号元件与ABA信号元件在跨膜水分传输中的互作

摘要

水分在植物的生长发育进程中起着至关重要的作用，水分平衡的维持对高等植物营陆生固着生活和抵御各种环境逆境必不可少。现已知植物细胞的透水性和水分在植物体内的传输与植物对各种非生物逆境的响应紧密相关，说明通过调节水分的传输进而调控植物的适应性是可行的。目前植物中发现的大多数信号分子都能够调节植物的水力学特性，其中硝酸盐(NO3-)和植物激素ABA无论从理论上还是实践上对优化植物水分关系都非常重要。但是这两种信号分子在调节植物水分传输中是否有互作，以及互作的分子机制尚不清楚，探究ABA信号与NO3-信号在调节植物水分跨膜传输中的互作对深入揭示逆境下植物水力学特性的精细调控具有重要的意义。
　　1、本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为试验材料，通过蛋白互作软件预测得到蛋白磷酸酶AtABI2与蛋白激酶AtCIPK8，水孔蛋白AtPIP1.1与AtCIPK8，以及AtPIP1.3与NO3-转运体AtNRT1.2这三对组合间均存在互作，这为进一步通过生物化学方法鉴定它们之间的互作奠定了基础。
　　2、以野生型拟南芥Col-0的cDNA为模板扩增得到AtABI2、AtCIPK8、AtPIP1.1、AtPIP1.3与AtNRT1.2的基因，分别将其连接到BiFC载体上，构建成重组表达载体AtABI2-SPYCE、AtCIPK8-SPYNE、AtPIP1.1-SPYCE、AtPIP1.3-SPYCE和AtNRT1.2-SPYNE。转化农杆菌EHA105后侵染本氏烟草，瞬时表达观察蛋白互作情况。结果表明拟南芥水孔蛋白AtPIP1.1和AtPIP1.3可分别与AtCIPK8和AtNRT1.2发生互作。同时，蛋白激酶AtCIPK8与AtABI2之间也可发生互作，共聚焦显微镜观察发现互作定位于细胞膜。
　　3、在分离泛素化酵母双杂交系统中，以拟南芥水孔蛋白AtPIP1.1和AtPIP1.3以及AtABI2分别与pBT3-N构建的重组载体作为诱饵，以拟南芥AtCIPK8和AtNRT1.2分别与pPR3-N构建的重组载体作为猎物，共转化酵母菌株后进行互作分析。结果发现三个转化组在4缺培养基上都有菌落生长。进一步验证了拟南芥AtPIP1.1与AtCIPK8、AtPIP1.3与AtNRT1.2以及AtCIPK8与AtABI2之间能发生互作，从而为进一步揭示ABA信号与NO3-信号参与拟南芥水分调节的信号转导分子机制奠定基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1．2 NO3-信号与水分传输

1．1．3 NO3-信号与ABA信号间的互作

1．2 ABA信号概述

1．2．1 ABA受体种类

1．2．2 ABA信号的感知和转导

1．2．3 ABA信号与水分传输

1．3 本研究的目的与意义

第二章 BiFC鉴定NO3-信号与ABA信号的互作

2．1 试验材料、试剂及仪器

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验试剂

2．1．3 试验仪器

2．2 试验方法

2．2．1 运用生物信息学知识预测互作蛋白

2．2．2 PCR引物设计

2．2．3 cDNA全长的获得

2．2．4 目的基因的扩增与回收

2．2．5 感受态的制备及转化

2．2．6 质粒的提取与鉴定

2．2．7 BiFC重组表达载体构建

2．2．8 重组质粒转化农杆菌EHA105

2．2．9 瞬时表达

2．3 结果与分析

2．3．1 目的蛋白互作预测结果

2．3．2 目的基因功能描述

2．3．3 目的基因PCR扩增结果

2．3．4 目的基因BiFC重组表达载体构建

2．3．5 互作蛋白在烟草叶片表皮细胞中的表达与观察

第三章 酵母双杂交对NO3-信号与ABA信号的互作验证

3．1 试验材料

3．1．1 菌株和质粒

3．1．2 试验试剂

3．2 试验方法

3．2．1 表达载体的构建

3．2．2 阳性克隆的筛选与酶切鉴定

3．2．3 酵母感受态细胞制备(LiAc法)

3．2．4 重组质粒共转化酵母感受态

3．3 结果与分析

3．3．1 酵母菌株的活化

3．3．2 重组质粒的构建与鉴定

3．3．3 酵母重组质粒的转化结果

3．3．4 酵母双杂交验证互作结果

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

作者简介