苜蓿中华根瘤菌Cu/Zn抗性机制及其促进天蓝苜蓿对重金属的吸收作用

摘要

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)CCNWSX0020是从陕西风县尾矿区生长的天蓝苜蓿根瘤内分离出来的一株菌，不仅具有多种重金属抗性，还能促进天蓝苜蓿在Cu污染土壤中生长。这种双重特性使得该共生体系成为重金属污染土壤修复的有效工具。本文通过RNA-Seq、基因敲除等技术分析了S.meliloti CCNWSX0020的Cu/Zn抗性机制，并对Cu/Zn抗性因子在根瘤菌-豆科植物共生体系及其生物修复Cu/Zn污染土壤中的作用进行了研究。
　　通过转录组分析揭示了S.meliloti CCNWSX0020在四种胁迫条件下的基因表达模式。首先不考虑不同重金属处理间的基因表达模式的差异，由短期的(30min)重金属诱导表达的基因数目远远多于长期的(24h)重金属处理，表明多数早期即时响应的基因应对重金属胁迫时发挥了第一道防线作用，而少数长期表达的基因必然在S.meliloti CCNWSX0020重金属抗性机制中发挥重要作用。在Cu或Zn长期胁迫下，编码P1B-typeATPase、多铜氧化酶、外膜蛋白和金属结合蛋白的基因表达量显著上调，说明S.meliloti CCNWSX0020可能通过外排、氧化或隔离等机制来解毒。此外，通过分析不同的重金属胁迫对基因表达模式的影响，发现Zn诱导下54％的表达上调的基因也受Cu共同诱导，其主要集中在离子转运、能量产生、氧化还原反应、碳水化合物和氨基酸代谢等过程，说明S.meliloti CCNWSX0020通过多种途径来防御非特异性的金属损伤，或调整整个细胞的代谢水平来适应外界的环境胁迫。除了共同响应Cu和Zn诱导的基因外，还有一些金属特异性的转录调节因子、转运蛋白、分子伴侣等被Cu或Zn诱导表达，说明S.meliloti CCNWSX0020对细胞内Cu/Zn的稳态调节是复杂精细的，且对Cu/Zn的解毒或抗性机制有所不同。
　　P1B-type ATPases是细菌中非常重要的金属离子外排系统。S.meliloti CCNWSX0020中存在五个P1B-type ATPase，通过基因敲除和功能互补实验证实其中CopA1b和ZntA两个P1B-type ATPase与Zn/Cd/Pb抗性相关。根据序列同源性分析，CopA1b属于P1B-1ATPases，而ZntA属于P1B-2ATPases。S.meliloti CCNWSX0020中zntA基因的表达受Zn2+/Cd2+/Pb2+诱导，且zntA基因缺失后造成细胞对Zn/Cd/Pb高度敏感，菌体内大量Zn/Cd/Pb积累，说明S.meliloti CCNWSX0020中的ZntA是一个典型的Zn2+-ATPase，参与细胞内Zn2+/Cd2+/Pb2+的外排。而S meliloti CCNWSX0020中copA1b基因的表达受Cu+/Ag+诱导，但copA1b基因缺失后不影响细胞的Cu耐受性，反而对高浓度的Zn/Cd/Pb敏感，造成菌体内Zn/Cd/Pb积累，说明S.meliloti CCNWSX0020中的CopA1b虽然属于P1B-1ATPases，但也可能参与细胞内的Zn2+/Cd2+/Pb2+的稳态调节。
　　通过基因缺失突变验证了S.meliloti CCNWSX0020中六个Cu/Zn胁迫下表达显著上调的基因与Cu/Zn抗性相关。金属敏感性检测显示，△cueO对Cu专一敏感，其他几个突变体则对Cu/Zn/Cd/Pb不同程度敏感，说明CueO发挥专一性地抗Cu作用，而其他几个基因与S.meliloti CCNWSX0020的Cu/Zn/Cd/Pb耐受性有关。同时，选取S.meliloti CCNWSX0020野生型、Cu敏感突变体△cueO和三个Cu/Zn敏感突变体（△cusA-tike，△yedYZ，△fixH-like），来研究重金属抗性因子对生物修复的作用。结果显示，无论在有无重金属胁迫条件下，△cusA-like突变菌株几乎丧失了与天蓝苜蓿共生的能力;cueO基因缺失严重抑制了Cu胁迫条件下△cueO突变菌株与天蓝苜蓿的侵染和结瘤过程;在Cu和Zn胁迫条件下，yedYZ或xH-like基因缺失降低了△yedYZ或△fixH-like突变菌株对天蓝苜蓿早期的侵染频率和结瘤数目，但不影响最终的结瘤固氮能力。此外，接种四个突变体的植物体内的抗氧化酶活性以及Cu和Zn含量明显低于接种野生型菌株的植物。由此说明在重金属污染土壤中，重金属抗性因子可以通过直接或间接地影响根瘤菌-豆科植物共生体系来促进植物对重金属的吸收。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 微生物对Cu／Zn的抗性机制

1．2．1 Cu／Zn毒性的分子机制

1．2．2 微生物对Cu的抗性机制

1．2．3 微生物对Zn的抗性机制

1．2．4 根瘤菌的重金属抗性机制

1．3 重金属抗性的根瘤菌促进重金属污染土壤的生物修复

1．3．1 植物根际促生菌-植物联合修复重金属污染土壤

1．3．2 根瘤菌在微生物-植物联合修复中的作用

1．3．3 根瘤菌重金属抗性因子的作用

1．4 研究内容及技术路线

1．4．1 本文选题依据

1．4．2 本文研究内容

1．4．3 本文技术路线

第二章 Cu和Zn胁迫下S．meliloti CCNWSX0020的转录组分析

2．1 引言

2．2 实验材料和仪器

2．2．1 供试菌株和培养基

2．2．2 实验试剂

2．2．3 主要仪器

2．3．2 S．meliloti CCNWSX0020 RNA提取

2．3．3 RNA质量检测

2．3．4 RNA-Seq测序流程

2．3．5 测序数据分析

2．3．6 转录组测序数据验证

2．4 结果与分析

2．4．1 菌株纯化检测

2．4．2 RNA样品检测

2．4．3 转录组测序结果

2．5 讨论

第三章 S．meliloti CCNWSX0020中P1B-type ATPase功能研究

3．1 引言

3．2 实验材料和仪器

3．2．1 供试菌株和培养基

3．2．2 实验所用试剂(盒)

3．2．3 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．2 基因敲除

3．3．3 突变体重金属敏感性检测

3．3．4 重金属敏感的突变体功能互补分析

3．3．5 细胞内重金属含量测定

3．3．6 抗氧化分析

3．3．7 实时荧光定量PCR分析

3．4 结果与分析

3．4．1 S．meliloti CCNWSX0020中的P1B-type ATPase生物信息学分析

3．4．2 基因敲除突变体构建

3．4．3 突变体金属敏感性检测

3．4．4 突变体功能互补分析

3．4．5 copA1b和zntA基因的表达分析

3．4．6 细胞内重金属含量测定

3．4．7 突变体抗氧化酶活性测定

3．5 讨论

第四章 Cu／Zn抗性相关操纵子的功能验证

4．1 引言

4．2 实验材料和仪器

4．2．1 供试菌株和培养基

4．2．2 实验所用试剂(盒)

4．2．3 主要仪器

4．3 实验方法

4．3．1 生物信息学分析

4．3．2 基因表达分析

4．3．3 共转录验证

4．3．4 基因敲除突变体构建

4．3．5 突变体重金属敏感性检测

4．4 结果与分析

4．4．1 Cu／Zn抗性相关基因的生物信息学分析

4．4．2 Cu／Zn抗性相关操纵子的基因表达分析

4．4．3 突变体的重金属敏感性检测

4．5 讨论

第五章 重金属抗性因子对植物修复重金属污染土壤的促进作用

5．1 引言

5．2 实验材料和仪器

5．2．1 供试菌株和培养基

5．2．2 实验所用试剂(盒)

5．2．3 主要仪器

5．3 实验方法

5．3．1 构建表达绿色荧光蛋白的根瘤菌

5．3．3 植物各项生长指标测定

5．3．4 根瘤石蜡切片制作和观察

5．3．5 植物N含量测定

5．3．6 植物重金属含量测定

5．3．7 植物抗氧化酶活性测定

5．4 结果与分析

5．4．1 Cu／Zn敏感突变体对结瘤的影响

5．4．2 Cu／Zn敏感突变体对植物生长的影响

5．4．3 Cu／Zn敏感突变体对植物重金属吸收的影响

5．4．4 Cu／Zn敏感突变体对植物抗氧化酶活性的影响

5．5 讨论

第六章 结论与创新

6．1 结论

6．1．3 MCO操纵子参与S．meliloti CCNWSX0020的多种重金属抗性机制

6．1．4 假定的CopG操纵子是—个新的重金属抗性操纵子

6．1．5 YedYZ操纵子与S．meliloti CCNWSX0020多种重金属抗性有关

6．1．6 重金属抗性因子对植物修复的促进作用

6．2 创新点

参考文献

附录

缩略词(Abbreviations)

致谢

作者简介