奶山羊乳铁蛋白(LF)基因克隆及启动子区转录活性研究

摘要

乳蛋白是山羊乳的主要营养成分，具有含多种活性成分、营养价值高、易消化吸收等特点，其种类及其在乳中的浓度都影响乳品质。乳铁蛋白（lactoferrin, LF）是乳蛋白的主要组分，是一种重要的生理活性物质，具有广泛而独特的理化特性和生物活性，在食品、乳品、生化、医药、饲料、化妆品等领域应用前景广阔。因此，通过克隆奶山羊LF基因及研究其启动子功能解析乳腺上皮细胞乳铁蛋白的转录调控机制，获得的试验材料及研究理论对奶山羊育种及羊乳成分调控具有实际应用价值和重要理论意义。 本研究以山羊的基因组序列为模板，在PCR技术扩增得到奶山羊LF基因CDS区、启动子全长序列的基础上，使用软件和在线网站进行生物信息学分析；通过5＇端缺失，构建8个包含LF启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体，利用萤火虫荧光素酶活性报告系统检测不同片段启动子活性，以期确定启动子最小活性中心；并通过定点突变ERE，分析了对山羊LF启动子活性的影响。得到主要结果如下： 1.克隆得到奶山羊LF基因CDS区全长。LF基因CDS全长2 127bp，编码708个氨基酸，LF基因蛋白二级结构主要由α-螺旋和不规则卷曲组成，并预测得到了LF基因三级结构3D模型图。ELISA检测奶山羊不同泌乳时期（泌乳初期、泌乳盛期、泌乳中期、泌乳末期）乳中LF蛋白浓度，发现随着泌乳时期延长，LF蛋白浓度呈现出下降趋势，泌乳初期最高，为222.6±41.57 μg/mL；之后下降并保持一个稳定的范围，为34.61~51.94 μg/mL。 2.成功克隆得到山羊LF启动子区大小为2 070 bp的片段，与GenBank公布的牛（AY319306.2）、人（AF508798.1）、小鼠（M74778.1）的同源性分别为89.2%、55.25%、39.85%。生物信息学分析发现，克隆得到的LF启动子区片段包括转录起始位点 （+1）上游1 935 bp、第Ⅰ内含子（+1～+36）、第Ⅰ外显子（+37～+119）和第Ⅱ内含子的部分序列（+120～+135），ATG位于第Ⅰ外显子上。LF启动子片段序列G/C含量为52.39％，并且该区域上有非典型的真核生物元件TATA-box。生物信息学分析表明，LF启动子上存在PPAR-γ、PPAR-α、LXR-α、C/EBP-α、Sp1和NF-Y等转录因子的结合位点。 3.启动子缺失片段的荧光素酶活性分析表明，LF启动子的核心区域位于-84~-46 bp，并且在启动子上游存在正调控元件。同时序列分析发现，在启动子的上游区域含有ERE位点。定点突变分析发现，突变 ERE 三个位点均能显著下调启动子的活性，因此，LF启动子上存在三个功能性ERE元件（-1038 bp、-1144 bp和-1777 bp）。 综上所述，山羊LF基因CDS区全长为2 127bp，LF在泌乳初期乳中浓度较高。克隆得到山羊LF启动子区2 070bp片段，山羊LF启动子5'侧翼序列与牛的同源性较高，启动子核心区域定位在-84~-46 bp之间，功能性ERE元件对维持启动子转录基础活性具有重要作用，初步研究并揭示了LF基因转录调控机制。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 羊乳中乳蛋白组成及其营养价值

1.2 乳铁蛋白（LF）的研究进展

1.3 真核生物启动子的研究进展

1.4存在的问题

1.5 本研究的目的和意义

第二章 山羊LF基因CDS区的克隆、序列分析与乳中蛋白浓度测定

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 本章小结

第三章 山羊LF启动子克隆及生物信息学分析

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 本章小结

第四章 LF启动子活性区域的研究

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 本章小结

第五章 ERE位点突变对山羊LF启动子转录活性的影响

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

5.4 本章小结

结论

参考文献

附录一

附录二

附录三

附录四

附录五

附录六

附录七

附录八

致谢

作者简介