细胞自噬在猪细小病毒复制过程中的作用

摘要

猪细小病毒（porcineparvovirus, PPV）属于细小病毒科、细小病毒属成员，是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一。PPV一般在猪源性生长分裂旺盛的细胞中进行增殖，感染PPV的细胞会产生明显的细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）。细胞自噬作为细胞中维持稳态的重要方式，在病毒致病过程中发挥了重要作用。虽然关于细胞自噬与病毒间的相互作用机制研究已有很多报道，但细胞自噬如何调控 PPV 的复制，至今尚不清楚。本研究以PK-15细胞作为模式细胞，用PPV感染PK-15细胞和GFP-LC3质粒转染的PK-15细胞，western blotting检测细胞自噬相关蛋白的表达变化，在荧光显微镜下观测自噬体的形成。以PPV感染PK-15细胞、利用自噬诱导剂建立的PK-15细胞自噬模型、利用siRNA技术干扰自噬关键基因atg5的PK-15细胞，western blotting检测细胞自噬相关蛋白的表达、PPV VP2的表达，Real-time Q-PCR检测PPV的拷贝数和PPV VP2的mRNA水平。研究取得以下结果。 1.以0 MOI、0.25 MOI、0.50MOI、0.75 MOI、1.0 MOI、1.25 MOI PPV感染PK-15细胞24 h，western blotting检测发现，细胞自噬相关蛋白LC3-II随MOI增大而表达量升高，p62无明显降低；以1.0MOI的PPV感染PK-15细胞0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h，western blotting检测发现，LC3-II和p62的表达量在感染12 h开始上升，并随感染时间的延长而不断上升。利用GFP-LC3质粒转染PK-15细胞12 h后，再以0 MOI、0.75 MOI、1.0 MOI、1.25 MOI PPV感染转染后的PK-15细胞，同时，以1.0MOI的PPV感染转染后的PK-15细胞0 h、12 h、24 h、36 h。荧光显微镜下观察发现，病毒梯度组中，自噬体在感染0.75 MOI后开始出现，且随MOI增大而增多。时间梯度组中，自噬体出现于PPV感染12 h后，且随时间的延长而增多。 2.EBSS处理PK-15细胞4 h构建细胞自噬模型，western blotting检测显示，经EBSS诱导后的PK-15细胞中LC3-II表达量明显增加。然后，用1.0 MOI的PPV感染EBSS处理的细胞24 h后，western blotting检测显示，PPV VP2的表达量明显升高；提取PK-15细胞总DNA，Real-time Q-PCR检测到EBSS处理的细胞中的PPV拷贝数极显著高于对照组（P<0.01）；提取PK-15细胞总RNA，反转录为cDNA后，Real-time Q-PCR检测到EBSS处理的细胞中PPVVP2 mRNA水平极显著高于对照组（P<0.01）。 3.利用siATG5对PK-15细胞自噬关键基因atg5的特异位点进行干扰，阻断atg5基因的活性，western blotting结果显示，siATG5转染后抑制了atg5基因的表达。然后siATG5转染EBSS处理的细胞，western blotting结果显示，LC3-II表达量下降，p62表达量略有升高。1.0 MOI PPV感染PK-15细胞、siATG5转染的PK-15细胞、EBSS处理细胞24 h，westernblotting检测结果显示，EBSS处理细胞PPVVP2升高，而siATG5转染的PK-15细胞的PPV VP2表达明显降低。提取PK-15细胞总DNA，Real-time Q-PCR检测结果显示，siATG5转染的PK-15细胞PPV拷贝数极显著低于对照组（P<0.01）。提取PK-15细胞总RNA，反转录为cDNA后，Real-time Q-PCR检测结果显示，siATG5转染的PK-15细胞PPV VP2 mRNA水平极显著低于对照组（P<0.01）。 本研究发现了PPV感染可诱导PK-15细胞产生自噬，明确了细胞自噬促进PPV的复制。干扰自噬关键基因 atg5 后，细胞自噬被抑制，PPV 的复制也受到显著抑制。该研究揭示了细胞自噬对PPV复制具有促进作用，证实了自噬基因atg5在细胞自噬促进PPV复制中发挥了关键作用。研究结果为进一步阐明PPV致病机制提供新的理论依据。

目录

声明

前言

第一章 细胞自噬在动物病毒致病过程中的作用研究进展

1.1细胞自噬及其调控机制

1.2 细胞自噬在动物病毒致病过程中的作用

1.3 本研究的目的与意义

第二章 PPV感染PK-15细胞诱导细胞自噬

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 细胞自噬对PPV复制的调控作用

3.1试验材料

3.2试验方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

结论与创新点

结论

创新点

参考文献

缩略词

致谢

作者简介