猪细小病毒感染ST细胞可诱发自噬并促进病毒的复制

摘要

猪细小病毒病(Porcine parvovirus infection，PPI)是由猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)引起的一种病毒性传染病。该病主要临床表现为胚胎以及胎儿的感染，发生畸形胎、木乃伊胎甚至死胎。PPV是造成母猪繁殖障碍的主要原因之一，对养猪业构成了巨大威胁，造成了全球范围内的巨大经济损失。自噬是细胞自我防御和自我保护的一种生理过程，尽管许多病毒在进入细胞或复制时可引起细胞自噬，但自噬和PPV感染之间的关系尚未见报道。因此本文将研究PPV感染猪睾丸细胞(ST)后对细胞自噬的影响，同时研究自噬是否能够促进PPV病毒的复制。 本文应用Western blot、间接免疫荧光和荧光定量PCR方法对PPV感染ST细胞后自噬的发生及其自噬与病毒复制之间的互作机制进行了研究。结果如下:Western blot实验表明，随着时间延长，雷帕霉素处理组和PPV感染组与正常对照组相比，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化增加，p62的水平显著降低。间接免疫荧光检测表明PPV感染ST细胞中出现大量阳性荧光斑点状GFP-LC3蛋白，与雷帕霉素处理组相似，而在正常对照组细胞中GFP-LC3阳性荧光为弥散分布。透射电镜观察可发现PPV感染和雷帕霉素处理ST细胞中有自噬体样囊泡结构出现。上述结果表明PPV感染ST细胞后可诱导其发生自噬。在自噬是否能够促进病毒复制实验中，Western blot检测表明雷帕霉素可显著增加PPV VP2的表达，而当添加自噬抑制剂渥曼青霉素时PPV VP2的表达极显著减少。PPV TCID50测定中，PPV感染后雷帕霉素处理组较PPV感染组病毒滴度增加，反之，用渥曼青霉素处理后PPV滴度降低。实时荧光定量PCR检测病毒拷贝数实验也得到了相似的结果。同时，随着雷帕霉素浓度的增加，病毒拷贝数逐渐增加。说明PPV在ST细胞中诱导的自噬可有利于病毒的复制。 总之，本研究证实PPV感染ST细胞后可诱导自噬的发生，而且自噬的发生反向促进其自身的复制，这可能是病毒感染宿主细胞的机制之一，有助于进一步阐明PPV感染的发病机制，并为有效防治该病提供理论和实践依据。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 猪细小病毒病的研究进展

1．1．1 猪细小病毒的基因组结构

1．1．2 猪细小病毒的主要蛋白和功能

1．1．3 猪细小病毒病流行病学

1．1．4 猪细小病毒致病机制

1．1．5 猪细小病毒病毒临床症状和病理变化

1．1．6 猪细小病毒病的诊断

1．1．7 猪细小病毒病的防治

1．2 自噬

1．2．1 自噬分类及特征

1．2．2 自噬的过程

1．2．3 自噬的检测

1．2．4 自噬的生理意义

1．2．5 自噬与病毒感染的相互作用

1．3 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验病毒株、细胞与菌种

2．1．2 试剂盒、工具酶、抗体以及试剂

2．1．3 主要试剂的配制及保存

2．1．4 实验仪器与设备

2．2 实验方法

2．2．1 PPV感染ST细胞条件的建立

2．2．2 Western blot检测PPV感染ST细胞后自噬相关蛋白的变化

2．2．3 间接免疫荧光检测PPV感染ST细胞后GFP-LC3荧光变化

2．2．4 透射电镜观察PPV诱导ST细胞的自噬体形成

2．2．5 Western blot检测自噬对病毒复制的影响

2．2．6 TCID50方法检测自噬对病毒复制的影响

2．2．7 实时荧光定量PCR检测自噬对病毒复制的影响

2．2．8 统计学分析

3 结果

3．1 PPV感染ST细胞条件的建立

3．1．1 PPV感染ST细胞CPE的观察

3．1．2 PPV感染ST细胞后的PCR鉴定

3．1．3 PPV TCID50的测定

3．2 PPV诱导ST细胞自噬的产生

3．2．1 Western blot检测PPV感染ST细胞后自噬相关蛋白的变化

3．2．2 间接免疫荧光检测PPV感染ST细胞后GFP-LC3荧光变化

3．2．3 PPV感染ST细胞后自噬泡的电镜观察

3．3 自噬对病毒复制的影响

3．3．1 Western blot分析自噬对病毒复制的影响

3．3．2 病毒滴度TCID50的测定

3．3．3 实时荧光定量PCR检测病毒拷贝数

4 讨论

4．1 PPV病毒诱导ST细胞自噬的发生

4．1．1 Western blot检测PPV感染ST细胞后自噬相关蛋白的变化

4．1．2 间接免疫荧光检测PPV感染ST细胞后GFP-LC3荧光变化

4．1．3 透射电镜分析病毒诱导自噬体的产生

4．2 PPV感染ST细胞引起自噬并促进其复制

4．2．1 Western blot分析自噬对病毒复制的影响

4．2．2 病毒滴度TCID50的检测和分析

4．2．3 PPV拷贝数的检测和分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文