蒺藜苜蓿重金属转运P型ATP酶基因HMA7在共生结瘤过程中的功能研究

摘要

重金属转运P型ATP酶HMAs (heavy metal P1B-ATPases)已被证实参与植物体内的重金属运输，HMA7（也称 RAN1）可将铜离子传递给乙烯受体，乙烯在铜离子的存在下与受体结合，从而启动乙烯通路的表达。相关研究表明，乙烯对豆科植物共生结瘤起抑制作用，但HMA7在其中的功能尚不为人知。为了探究重金属转运P型ATP酶基因HMA7对共生结瘤的影响，通过对全基因组已测序的模式豆科植物蒺藜苜蓿的基因组进行筛查，得到两个HMA7类候选基因MTR_2g035840和MTR_4g094695，在对其表达模式分析的基础上，对 MTR_2g035840 进行亚细胞和组织定位，并对两个目的基因进行RNA干扰及对MTR_2g035840进行过表达研究，以分析其在根瘤形成中的作用。 1、两个目的基因的表达模式分析 共生条件下检测两个目的基因的表达显示，MTR_2g035840和MTR_4g094695在共生后期表达量上调，推测其在根瘤成熟晚期发挥作用。组织表达分析表明， MTR_2g035840 主要在根瘤中表达，MTR_4g094695 主要在根中表达。不同铜浓度处理下，与对照相比，MTR_2g035840在铜浓度为50mg kg-1和200mg kg-1的共生前期和后期的表达量下调，MTR_4g094695则主要受到200mg kg-1铜的影响，其在接种不同时期呈现不同变化，推测它们在铜离子的吸收或转运等过程中发挥不同的作用。 2、MTR_2g035840的定位分析 构建MTR_2g035840的烟草叶片亚细胞定位载体，利用农杆菌介导的烟草细胞瞬时转化体系，将目的基因分别与高尔基体（GmMAN1）和内质网（AtCHS）标记基因进行共转化，在激光共聚焦显微镜下观察目的基因与 GmMAN1、AtCHS 的共定位情况，结果表明，目的基因主要定位于内质网上。通过构建MTR_2g035840启动子::GUS融合表达载体，通过农杆菌发根转化的方式转入蒺藜苜蓿根部，经培养后，进行GUS 染色观察，结果表明，该基因主要在根瘤的分生区和固氮区以及整个根组织中表达。 3、目的基因的RNA干扰和过量表达转化植株的的生长及结瘤情况分析 构建MTR_2g035840和MTR_4g094695干扰载体及MTR_2g035840的过量表达载体，通过发根农杆菌介导的植物转化方法将重组载体导入蒺藜苜蓿根部，形成转基因的嵌合植株。分别从根瘤菌的侵染事件、植株的形态生理指标、相关基因的时空表达和根瘤的显微结构等方面进行分析。结果显示，与对照组相比，RNAi-40和RNAi-95转化植株生长没有明显差别；侵染事件分析显示，RNAi-40除根瘤原基数目有明显下降外，其根毛卷曲、根毛侵染线、皮层侵染线数目无明显变化，RNAi-95侵染事件无明显变化；透射电镜分析表明，RNAi-40组根瘤细胞无明显变化，RNAi-95类菌体发生了收缩，部分共生体出现融合现象；MTR_2g035840过表达对根瘤菌侵入及结瘤过程产生了明显的抑制作用，侵染事件观察表明，其皮层侵染线和根瘤原基数目明显减少，接菌后第28d根瘤数也明显减少，透射电镜结果表明过表达组根瘤内单个侵染细胞内的类菌体密度减少，类菌体形态也多不规则。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 豆科植物与根瘤菌之间的共生作用

1.2 乙烯在共生根瘤形成中的作用

1.3 植物中铜离子的运输

1.4 研究的目的与意义

1.5 技术路线

第二章 目的基因的筛选与表达模式分析

2.1 引言

2.2 实验材料和仪器

2.3实验方法

2.4 结果与分析

2.5 小结与讨论

第三章 MTR_2g035840基因的表达定位分析

3.1 引言

3.2 实验材料、试剂和仪器

3.3 实验方法

3.4 结果与分析

3.5 小结与讨论

第四章 目的基因的RNA沉默和过表达

4.1 引言

4.2 实验材料、试剂和仪器

4.3 实验方法

4.4 结果与分析

4.5 小结与讨论

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录1

附录2

附录3

致谢

作者简介