SerpinB1在猪胰腺干细胞增殖及向胰岛素分泌细胞分化中的作用及机理

摘要

糖尿病是一种代谢类疾病，又称高血糖症，表现为多食、多尿、多饮、体重减少。长期的高血糖引起机体多个组织器官的损伤，尤其是眼、肾、心脏、血管和神经等的功能障碍。胰岛β细胞损伤是糖尿病的症结所在。猪的胰腺干细胞（Pocine Pancretic Stem Cells，pPSCs）是从胎猪胰腺中分离出来的一种成体干细胞，在细胞中转入大T载体形成永生化细胞系，实验室先前的研究证明该细胞经化学小分子诱导可分化为胰岛素分泌细胞。又因猪的基因组以及胰岛素的结构与人的相似性，所以研究pPSCs对未来糖尿病的临床治疗具有深远的意义。 SerpinB1是一种蛋白酶抑制剂，通过抑制蛋白酶活性缓解由炎性反应所引起的组织损伤。有研究表明，肝的胰岛素抵抗促进了 SerpinB1 的分泌，作用于胰腺促进胰岛 β细胞的增殖，并且这一反应与其蛋白酶抑制剂活性相关。干细胞的自我更新和分化受到机体内多种细胞因子的调控，胰腺干细胞作为一种成体干细胞，SerpinB1对成体干细胞-猪胰腺干细胞的影响目前仍不清楚。 本实验探究了SerpinB1对pPSCs中影响及作用机理。通过超表达和干扰pPSCs中SerpinB1的表达，一方面证实超表达SerpinB1可以促进pPSCs的增殖，另一方面发现SerpinB1在pPSCs诱导分化后期表达量增加，干扰SerpinB1影响了pPSCs的诱导分化效率，不利于胰岛素分泌细胞的形成。本实验为pPSCs的增殖机制提供了理论依据，另外为体外高效的获得胰岛素分泌细胞提供了新的思路和手段。 1. SerpinB1促进pPSCs的增殖 首先，通过运用qRT-PCR（实时荧光定量）对pPSCs中的SerpinB1的mRNA水平进行检测发现，SerpinB1在pPSCs中大量表达。随后一方面运用shRNA干扰SerpinB1在细胞中的表达，另一方面使细胞超表达SerpinB1。通过CCK-8检测发现干扰SerpinB1使细胞的活性降低，超表达SerpinB1 增强了细胞活性。随后的 EdU、流式细胞术周期检测以及qRT-PCR结果显示，与正常的细胞相比，干扰SerpinB1后细胞的EdU阳性率明显降低，处于S期的细胞比率下降，并且细胞中CDK2、PCNA以及CyclinD1的mRNA表达水平显著降低，说明SerpinB1促进pPSCs进入S期而促进pPSCs的增殖。Western blotting检测蛋白水平结果显示，超表达SerpinB1激活了STAT3、CDK2、和CyclinD1蛋白水平的表达，抑制了P53和P21的表达。所以我们推测SerpinB1通过STAT3信号通路促进pPSCs的增殖。 2. SerpinB1促进pPSCs诱导分化成胰岛素分泌细胞 首先，我们运用两步诱导法诱导pPSCs形成胰岛素分泌细胞，qRT-PCR和Western blotting的检测结果显示胰岛素分泌细胞中SerpinB1的表达水平显著升高。随后分别在诱导1d、3d、9d取样进行Western blotting检测发现，SerpinB1在整个诱导过程中的表达逐渐升高。其后，分别对干扰和超表达SerpinB1的pPSCs进行诱导，与对照组相比，发现干扰SerpinB1的表达后，诱导形成的胰岛素分泌细胞在悬浮诱导培养基中聚团松散不致密，培养基中存在大量悬浮的零散细胞，聚团后的细胞不易贴壁，细胞迁出率低， DTZ和Insulin染色显色不明显，在mRNA水平低表达Insulin、NeuroD、PDX1、Glut-2、Nkx6.1和MafA，并且ELISA检测发现，高糖刺激反应不灵敏。超表达SerpinB1后，在mRNA水平，Insulin、NeuroD、PDX1、Glut-2、Nkx6.1和MafA的表达明显升高，胰岛素分泌量显著性的增加。据此我们推测，SerpinB1影响了pPSCs向胰岛素分泌细胞的诱导效率。

目录

声明

第一章 SerpinB1在糖尿病和干细胞中作用的研究进展

1.1糖尿病的概况

1.1.1糖尿病概念及危害

1.1.2糖尿病的分类

1.2 糖尿病的治疗方法

1.2.1糖尿病的传统疗法

1.2.2获得功能β细胞的方法

1.3 SerpinB1与STAT3信号通路

1.3.1 SerpinB1概述

1.3.2 SerpinB1的研究进展

1.3.3 SerpinB1与β细胞增殖的关系

1.3.4 STAT3信号通路与细胞增殖

第二章 SerpinB1在胰腺干细胞增殖中的作用及机理

2.1材料

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.2方法

2.2.1 主要溶液配制

2.2.2 细胞培养与传代

2.2.3 SerpinB1干扰载体的构建及稳转细胞系的建立

2.2.4 SerpinB1超表达载体的构建及稳转细胞系的建立

2.2.5 CCK-8

2.2.6 EdU

2.2.7 细胞免疫荧光染色

2.2.8 qRT-PCR检测基因的表达

2.2.9Western blotting检测

2.2.10 流式细胞术检测细胞周期

2.2.11数据处理

2.3 结果

2.3.1 检测SerpinB1在pPSCs中的表达

2.3.2 构建SerpinB1超表达和干扰细胞系

2.3.3检测SerpinB1对pPSCs增殖的影响

2.3.4检测SerpinB1对pPSCs周期的影响

2.3.5检测STAT3信号通路的变化

2.4讨论

2.4.1 SerpinB1与pPSCs的周期的关系

2.4.2 SerpinB1与STAT3信号通路的关系

2.5小结

第三章 SerpinB1在猪胰腺干细胞向胰岛素分泌细胞分化中的作用

3.1 材料

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验试剂

3.1.3 实验仪器

3.2 方法

3.2.1主要溶液的配置

3.2.2胰岛素分泌细胞的诱导方法

3.2.3 qRT-PCR

3.2.4 Westernblotting

3.2.6葡萄糖刺激实验

3.2.7胰岛素ELISA检测

3.3结果

3.3.1 SerpinB1在pPSCs向胰岛素分泌细胞诱导分化过程中的变化

3.3.2 比较5组细胞系向胰岛素分泌细胞分化过程中的细胞表型

3.3.3 检测5组细胞系诱导形成的细胞胰岛素分泌情况

3.3.4 SerpinB1与诱导效率的关系

3.4 讨论

3.5 小结

结论

创新点

下一步的研究课题

参考文献

致谢

作者简介