猪流行性腹泻病毒陕西分离株的鉴定及全基因组序列分析

摘要

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种急性传染病，PEDV是猪重要的肠道病毒病原之一。本病以引起呕吐、严重腹泻和脱水为主要临床症状，对哺乳仔猪的危害最大， 5日龄内仔猪感染后的死亡率可达100%。近年来，PED在全世界范围内频繁爆发，给我国和世界养猪业造成了巨大的经济损失。研究表明，PEDV的变异是导致疫情频发的主要原因之一，因此，PEDV越来越成为当前猪病研究的热点。自2010年以来，本病在陕西省的猪群中发生率明显增多。本研究旨在对从陕西地区猪场中分离的PEDV进行全基因的克隆和序列分析，为猪流行性腹泻的流行病学调查提供一定的实验数据和研究素材，进而为本地区有效地防控PED提供理论依据和指导意义。 本研究以实验室保存的陕西某猪场的PEDV分离株命名为PEDV-SX株为研究对象，将病毒增殖后，首先通过RT-PCR扩增其S基因，并测序证实。序列分析结果显示：PEDV-SX株的S基因在碱基44-46位插入了3 nt (TTG) ，在碱基57-60位插入了4 nt (GGGT) ，在61-65位插入了5 nt (GTCAA) ，在418-420位插入了3 nt (AAT)；在碱基479-481位处缺失3 nt (GA)，同时存在多处点突变。初步证实该分离株为PEDV变异株。 应用DNAStar和MEGA软件对PEDV S基因序列进行序列分析，同时与35株国内外流行毒株进行系统进化分析和同源性分析。系统进化树结果表明，在35株PEDV参考株中，有16株PEDV参考毒株与PEDV-SX株在同一进化分支。中国株SH、中国株GD3、中国株AH2012与PEDV-SX株亲缘关系最近。在同源性方面，PEDV-SX株与中国株 SH、中国株 GD3、中国株 AH2012 的核苷酸同源性最高，与美国株ISU13-19338E-IN-homogenate、美国株USA/Colorado/2013、中国株GD3三株的氨基酸的同源性最高。 以GenBank上公布的PEDV标准株CV777和AH2012株的全基因组序列为根据，设计9对相互重叠、涵盖整个PEDV全基因组的引物，以提取的病毒总RNA为模板，通过RT-PCR扩增得到9个片段，经目的片段回收纯化、克隆测序和拼接，获得PEDV-SX株的全基因组序列。基因组全长28038bp（不含Poly（A）尾巴），与25株PEDV代表株进行比对分析，系统进化树结果显示：PEDV-SX株与中国株AH2012、莫斯科株MEX/124/2014、美国株ISU13-19338E-IN-homogenate、美国株USA/Colorado/2013、美国株 NPL-PEDv/2013/p10.1、美国株 13-019349 在同一进化分支。同源性分析表明PEDV-SX株与美国株NPL-PEDv/2013/p10.1、中国株LZC、中国株AH2012、美国株13-019349、美国株USA/Colorado/2013这5株参考毒株同源性较高。进一步通过结构基因与非结构基因的系统发育分析和同源性分析表明，PEDV-SX株与中国株AH2012亲缘关系最近，由此推测PEDV-SX株很有可能由我国早期PEDV毒株在猪群中进化而来。PEDV-SX株全基因组序列的获得将有助于我们了解陕西地区PEDV的遗传和变异情况，为陕西地区有效地防控PED提供一定的数据支撑。

目录

第一章 猪流行性腹泻病毒研究现状

1.1猪流行性腹泻病毒PEDV的世界流行状况

1.2猪流行性腹泻病毒PEDV的基因组结构

1.3临床症状及组织学病变

1.4病毒传播

1.5 PEDV肠内复制动力学

1.6 PEDV感染的免疫应答

1.7猪流行性腹泻病毒PEDV的细胞培养特性

1.8 PEDV的诊断方法概述

1.9猪流行性腹泻病PED的疫苗研究现状

1.10猪流行性腹泻病PED的防治

1.11 研究的目的及意义

第二章 猪流行性腹泻病毒陕西分离株的鉴定

2.1材料与方法

2.2结果及分析

2.3讨论

2.4小结

第三章 猪流行性腹泻病毒陕西分离株的全基因组序列测定及分析

3.1材料与方法

3.2结果及分析

3.3讨论

3.4小结

全文总结

参考文献

致谢

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