山羊CRISPR/Cas9基因编辑系统优化的研究

摘要

近年来，CRISPR/Cas9技术被广泛应用于动物基因编辑领域，与传统基因编辑技术相比较，CRISPR/Cas9技术设计更简单、靶向效率更高、位点特异性更强，适用于进行大规模的动物基因编辑。但是，CRISPR/Cas9技术制备的基因编辑动物可能出现脱靶效应，通过CRISPR/Cas9体系显微注射的方式对牛羊等大型单胎动物进行编辑的效率远远低于在多胎动物上进行编辑的效率。为了进一步提高对山羊等大型单胎动物进行基因编辑的效率、减少甚至消除 CRISPR/Cas9 系统引起的脱靶效应，我们以靶向山羊 FGF5基因的CRISPR/Cas9系统为例，对大动物基因编辑过程进行了优化。 本研究主要通过对sgRNA的设计过程、胚胎注射CRISPR/Cas9系统的组分和基因打靶策略三个层面对大动物基因编辑的CRISPR/Cas9系统进行了优化，得到了可用于对山羊FGF5基因进行靶向敲除的高效率、无脱靶效应的sgRNA，获得了可用于山羊胚胎微注射体系的最适浓度，发现了多基因打靶策略可大大提高山羊基因打靶的效率和获得纯合阳性编辑个体的可能。试验过程和主要结果如下： 1. sgRNA设计的优化。首先对目前已公布的、可设计用于CRISPR/Cas9系统sgRNA、可评估脱靶效应的 18 个软件进行比较，筛选出最适合山羊 sgRNA 设计的软件为sgRNAcas9；通过sgRNAcas9软件设计靶向山羊FGF5基因第一外显子的sgRNA，获得22个符合预设条件的sgRNA；选择脱靶可能性最小的8个sgRNA和之前研究中已获得的2个sgRNA，分别和Cas9质粒一起转入山羊胎儿成纤维细胞，对转染后细胞的编辑效率和脱靶效应进行检测，获得效率最优sgRNA为sg8。 2. CRISPR/Cas9体系微注射组分的优化。本研究设计了13个不同的CRISPR/Cas9体系微注射组合，其中试验组Cas9 mRNA浓度分别为10、20、50、100 ng/μL，Cas9 mRNA：sgRNA比值分别为20:1、4:1、2:1，对照组仅注射无RNA酶水；试验获得了362枚可注射的1细胞期胚胎，其中每组注射胚胎数25枚左右；对各组注射后胚胎的分裂率和编辑效率进行检测，结果表明当Cas9 mRNA浓度为50 ng/μL，Cas9 mRNA：sgRNA浓度比值为2:1时，胚胎编辑效率达到最高值66.7%。 3 基因编辑山羊打靶策略的优化及效果研究。本研究设计了3个靶向FGF5第一外显子区域的sgRNA，将3个sgRNA和Cas9 mRNA一起注射到山羊1细胞期胚胎中，将注射后胚胎移植到受体母羊体内，研究获得了 62 只羔羊；基因编辑效率检测结果表明32只羔羊发生了靶向编辑，阳性率为51.6%；其中28只羊为纯合敲除羊，4只为杂合子，纯合率为87.5%；结果表明3个sgRNA共同打靶的策略可大大提高山羊基因编辑效率。 综上所述，本研究建立了山羊的 sgRNA 的优化体系，该体系可用于山羊等其他动物的sgRNA的设计过程；获得了山羊CRISPR/Cas9系统微注射组分的最优组合，为今后基因编辑山羊及其他大动物的制备奠定了试验基础；证明了多个 sgRNA 共同打靶的策略可提高山羊的基因编辑效率和纯合编辑效率，这一打靶策略操作简单、效果显著，可用于山羊等其他大型哺乳动物的基因编辑过程。

目录

声明

第一章 CRISPR/Cas9系统及基因编辑羊的研究进展

1.1 CRISPR/Cas9系统研究进展

1.2 CRISPR/Cas9系统在羊上的研究

1.3 研究目的和意义

第二章 山羊sgRNA设计的优化

2.1方法

2.2结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 山羊CRISPR系统微注射组分的优化

3.1 方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4小结

第四章 基因编辑山羊打靶策略和效果的研究

4.1 方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4小结

第五章 结论

5.1 研究结论

5.2 创新点

5.3 下一步研究内容

参考文献

附录

致谢

作者简介