猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）作为一种猪病毒性传染病，其病原为PRRS病毒（PRRS virus，PRRSV）。目前PRRS在全世界的猪场广泛流行传播，造成了巨大的经济损失。2006年，我国突然爆发了猪高热病，其临床症状主要为持续高热，迅速死亡，传染性非常强，发病率接近 100%，同时引起妊娠母猪严重流产等繁殖障碍，对我国养猪业产生了巨大危害，该病病原随后被鉴定为高致病性PRRSV（highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV），该毒株是一种变异的PRRSV毒株。对于PRRSV的防控与净化目前还没有很好的方法，鉴于天然免疫在抗病毒过程中起着重要作用，因此需要进一步阐明其免疫机制，从而为该病的有效防控奠定基础。病毒感染宿主后，机体的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）会迅速识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），激活下游信号通路从而诱导干扰素（interferon, IFN），以及下游干扰素诱导基因（interferon-stimulated genes，ISGs）的大量产生，进而起到抗病毒作用。由于PRRSV具有免疫抑制的特性，之前的研究主要围绕在 PRRSV 蛋白对固有免疫的抑制效应及其机制，关于 PRRSV 如何被机体识别，以及诱导IFN产生的机制研究较少。本论文针对此问题进行了研究，取得的主要结果如下： 1、本研究首先采用RNA结合蛋白免疫沉淀及测序（RNA-Binding Protein Immunoprecipitation sequence，RIP-seq）等实验方法分析了PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophage，PAM）过程中，PRRSV基因组被黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）和视黄酸诱导基因I（RIG-I）识别的碱基序列，结果表明在PRRSV感染的PAM中，RIG-I和MDA5主要结合于PRRSV正链基因组的3’端非翻译区（3’ untranslated regions，3’ UTR），同时RIG-I和MDA5的结合有U/C和U/G碱基序列特异性。 2、PRRSV属于套式病毒目，其基因组和亚基因组都含有共同的5’和3’ UTR区域，对病毒的复制至关重要，同时本研究前期RIP-seq结果已证明，PRRSV 3’UTR区域对于免疫识别非常重要，因此我们进一步研究了PRRSV基因组5’和3’ UTR与免疫识别之间的关系。结果表明，PRRSV基因组的5’和3’ UTR能够刺激细胞产生IFN，并且位于PRRSV基因组3’ UTR的假结结构能够作为一种新的PAMP被模式识别受体RIG-I和Toll样受体3（Toll like receptor3，TLR3）识别，从而强烈地诱导IFN及ISGs的产生。由于假结结构是RNA病毒末端两个茎环相互作用形成的三级结构，能作为分子开关调节病毒RNA合成以及病毒复制，本研究发现此假结结构还能作为PAMP诱导抗病毒免疫应答，且将此假结结构相互作用破坏后其诱导 IFN 的能力显著降低。RNA-pull-down结果显示，RIG-I的调节区（regulation domain，RD）和TLR3的腔内区（ectodomain，ECD）均能与PRRSV基因组3’ UTR的假结结构RNA结合。在PAM中转染此假结结构能显著抑制PRRSV复制，表明该结构具有抗病毒能力。序列比对及二级结构预测显示，动脉炎病毒科其它成员在基因组3’ UTR都含有假结结构，此结构在动脉炎病毒科中非常保守，且这些病毒基因组的假结结构都能有效诱导IFN产生。 3、对猪源RIG-I的RD区（pRIG-I-RD）进行了表达和纯化，并采用凝胶过滤层析验证了pRIG-I-RD和PRRSV基因组3’ UTR假结结构RNA的相互作用。同时本实验采用小角散射（Small-angle X ray scattering，SAXS）技术分析了PRRSV 3’UTR假结结构RNA 与 pRIG-I-RD 复合物在溶液中的状态，结果显示其为细长的大分子结构，可能含有多个区域，至少有两个中心。由于PRRSV基因组的5’末端带有帽子，其识别机制与之前报道的机制不同，因此本研究为深入研究RIG-I识别模式奠定了基础。 综上所述，本研究鉴定了3’ UTR的假结结构可以作为病原相关分子模式特异性激活RIG-I和TLR3介导抗病毒免疫应答，并且该模式在动脉炎病毒科中非常保守。结合以往研究，我们提出了一个PRRSV基因组3’ UTR假结结构诱导IFN效应与PRRSV蛋白抑制 IFN 效应平衡的模型。在早期胞内体中，病毒基因组释放到细胞质内，基因组mRNA可以作为模板翻译复制转录酶蛋白（polyprotein precursors1a，pp1a）（polyprotein precursors1ab，pp1ab），经过切割后这些蛋白组装成复制转录复合体（replication and transcription complex，RTC），然后结合到PRRSV3’UTR区域起始负链RNA合成。在PRRSV复制过程中，PRRSV基因组3’ UTR假结结构能够被模式识别受体RIG-I的RD区和TLR3的ECD区识别并激活核转录因子κB（NF-κB）或干扰素调节因子3（IRF3）产生IFN。病毒的蛋白例如非结构蛋白1/2/4/11（nonstructural proteins 1/2/4/11， NSP1/2/4/11）和结构蛋白N蛋白可以通过靶向IRF3或NF-κB从而干扰宿主的抗病毒应答。因此，PRRSV基因组3’ UTR假结结构既能作为分子开关调节病毒RNA合成，同时可以影响天然免疫识别以及下游IFN产生。本研究为探索PRRSV免疫识别机制及发现RIG-I和MDA5新的识别特征奠定了重要研究基础。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1猪繁殖与呼吸综合征病毒概述

1.2 宿主模式识别受体和病原相关分子模式概述

1.3 PRRSV感染与宿主免疫应答

1.4 本研究的目的与意义

第二章利用RIP-seq对PRRSV PAMPs进行初步鉴定分析

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果与分析

2.5 讨论

2.6 小结

第三章 PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果与分析

3.5 讨论

3.6 小结

第四章 PRRSV基因组3’ UTR假结与RIG-I互作结构生物学研究

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 实验结果与分析

4.5 讨论

4.6 小结

全文总结

参考文献

创新点

缩略语及中英文对照

致谢

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