樱桃砧木抗旱性评价及应对干旱胁迫响应的生理和分子机制

摘要

甜樱桃（Prunus avium）隶属蔷薇科（Rosaceae）李属樱桃亚属（Prunus subgenus cerasus），是多年生落叶果树。樱桃因为上市早于其他水果被称为“春果第一枝”，果实营养丰富，经济价值高，在世界上多个国家成为主要的果树生产树种。由于甜樱桃经济效益显著，樱桃种植产业在我国发展迅速，成熟的栽植区域从渤海湾地区发展到西北、淮海及西南地区，在种植区日趋成为重要的农业经济产业。樱桃产业发展面临着多种产业障碍因素，其中干旱是影响北方地区樱桃产业发展的最主要的非生物逆境障碍因素之一。干旱影响樱桃生长、生殖和水分、营养吸收及转运，不同种质对干旱胁迫的响应不同，抗旱能力存在很大差异。樱桃砧木种质（Prunus subgenus cerasus）表现出抗旱能力差异性，然而有关抗旱差异性的机理尚不清楚。因此，本研究利用樱桃砧木种质作为研究对象，对比分析抗旱性与敏感性樱桃种质响应干旱的生理及分子响应的差异，探索其应对干旱的机理，挖掘抗旱基因，对于樱桃的抗旱性改良提供理论依据，筛选并培育抗旱性强的樱桃种质资源对于我国大面积的旱地利用具有重要意义。 （1）本研究以毛樱桃（P.tomentosa）、中国樱桃‘大青叶’（P.pseudocerasus）、吉塞拉樱桃‘Gisela5’及‘Gisela6’（P.cerasus×P.canescens）、考特樱桃‘Colt’（P.pseudocerasus×P.avium）、马哈利樱桃‘CDR-1’（P.mahaleb）和马哈利与草原樱桃杂交种‘CDR-2’（P.mahaleb×P.fruticosa）为研究材料，对其抗旱性进行评价。对樱桃砧木种质二年生扦插繁殖苗进行盆栽自然干旱处理，测定樱桃砧木的干旱响应生理生化指标，包括叶片相对含水量（RWC）、叶绿素（ChlorophyⅡ）、脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、过氧化物酶（SOD）、超氧歧化物酶（POD）和氧化氢酶（CAT）。依据生理指标测定值，采用隶属函数法计算各砧木的抗旱指数，同时参考砧木表型的受害程度将7个砧木的抗旱能力进行排序，由强到弱依次为：‘CDR-1’，‘CDR-2’，毛樱桃，‘Gisela6’，‘Colt’，‘大青叶’，‘Gisela5’。 （2）通过测定7个砧木在干旱胁迫下光合过程气体交换参数和叶绿素荧光参数，主要包括净光合速率（Pn）、叶片胞间二氧化碳浓度（Ci）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（E）、水分利用效率（WUE）、光化学最大量子效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ΦPSⅡ）、光化学淬灭系数（qP）和非光化学淬灭系数（NPQ），分析砧木的共性和差异性响应特征。发现在干旱条件下7个樱桃砧木光合能力差异较大，在重度干旱条件（SRWC35%-40%）下‘Gisela5’和毛樱桃相比其他砧木樱桃砧木光合能力受抑制程度更深；樱桃砧木能够接受的最低土壤含水量应该高于SRWC40%；SRWC60%-80%的土壤水分条件下樱桃砧木的光化合效率最高，光合速率和叶片水分利用效率最为理想。从光合指标分析结果来看，‘Gisela6’、‘CDR-1’、‘CDR-2’、‘Colt’和‘大青叶’相对于‘Gisela5’和毛樱桃，在重度干旱条件下的调节能力更强。 （3）采用对比分析转录组和代谢组的方法对抗旱差异性大的樱桃种质（抗旱性‘CDR-1’和干旱敏感性‘Gisela5’）进行干旱响应的相关基因和代谢物研究。通过RNA-Seq技术对比分析筛选了干旱响应差异表达基因：‘CDR-1’叶片中检测到281个上调基因和626个下调基因，根系中检测到84个上调基因和1079个下调基因；‘Gisela5’叶片中检测到79个上调基因，400个下调基因，根系检测到71个上调基因和205个下调基因。通过非靶标GC-MS检测技术总共筛选到了234个差异代谢物，其中92个上调差异代谢物，14个为共同上调差异代谢物，‘CDR-1’上调特异差异代谢物59个，‘Gisela5’上调差异代谢物19个，上调差异代谢物主要是有机酸、嘌呤、脂质、氨基酸、核苷酸碳水化合物衍生物和生物碱等。 通过对转录组和代谢组数据联合分析，发现碳水化合物代谢、植物激素的信号转导和植物次生代谢产物是与樱桃砧木干旱响应密切相关的重点调节过程，其中苯丙烷素合成途径和氰丙氨酸代谢途径涉及的差异性代谢路径是导致两个砧木抗旱差异性的关键因素：‘CDR-1’在干旱响应代谢中发生“奎尼酸→苯丙氨酸→对香豆酸”和“奎尼酸→苯丙氨酸→3-氰丙氨酸→天冬酰胺”两种途径，而‘Gisela5’则更倾向“奎尼酸→咖啡酸?绿原酸”和“奎尼酸→苯丙氨酸→3-氰丙氨酸→天冬酰胺”两种途径，且奎尼酸、苯丙氨酸、3-氰丙氨酸和天冬酰胺在‘CDR-1’和‘Gisela5’分别积累了183.0、1.3、4111229.0、7.0倍和1.5、1.2、2.0、2.6倍，表明‘CDR-1’的解氰效率和细胞保护性代谢物的合成效率高于‘Gisela5’，这是造成两个砧木抗旱差异性的主要原因。最终将6个差异代谢物包括奎尼酸、苯丙氨酸、3-氰丙氨酸、天冬酰胺、对苯醌和植物鞘氨醇确认为樱桃砧木干旱响应候选指示代谢物。基于樱桃砧木干旱响应差异基因的GO、KEGG分析和PPI互作网络分析，结合代谢物与基因联合分析结果，挖掘到4个参与能量代谢基因、3个泛素连接酶基因和1个锌指结构等17个核心候选基因，并对其进行了基础生物信息分析。最后，综合生理检测、转录组和代谢组的分析结果，总结绘制了‘CDR-1’干旱反应机理推导图。

目录

英文缩略表

第一章 文献综述

1.1 果树水分胁迫研究

1.1.1果树水分胁迫生理生化响应研究现状

1.1.2 果树应对干旱胁迫的分子机理研究

1.2 樱桃种质抗旱性评价研究

1.3‘组学’研究技术及其在植物逆境研究中的应用

1.3.1 高通量转录学及其在植物逆境研究中的应用

1.3.2 代谢组学在植物非生物逆境的应用

1.3.3 转录组学与代谢组学联合分析及其应用

1.4.1 研究思路

1.4.2 技术路线

第二章 樱桃砧木抗旱性评价

2.1.1 试验材料

2.1.2 试验方法

2.3.1 樱桃砧木在干旱胁迫下的生理生化响应

2.3.2 樱桃砧木抗旱评价结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 樱桃砧木在干旱条件下的光合作用响应分析

3.1 试验材料

3.2.1处理方法

3.2.2测定指标及方法

3.3 试验结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 抗旱性与敏感性樱桃砧木的转录组和代谢组比较分析

4.1.1 植物材料

4.1.2 处理方法

4.1.3 取样方法

4.2.1 样本RNA提取

4.2.2樱桃叶片及根系样本 cDNA文库构建及测序

4.2.3 基因表达分析及差异基因筛选

4.2.4 差异基因聚类分析

4.2.5 差异基因GO富集分析

4.2.6 差异基因KEGG富集分析

4.2.7 差异基因蛋白互作网络分析

4.2.8 实时定量PCR (qRT-PCR)基因表达量验证

4.2.9 代谢物提取和测定

4.2.10 代谢组数据分析

4.2.11 差异基因和差异代谢物联合分析

4.2.12 核心候选基因的筛选及生物信息学分析

4.3 试验结果

4.3.1 基于转录组的樱桃抗旱性与敏感性砧木在干旱处理下的共性与特异性分析

4.3.2 樱桃砧木干旱响应的通路分析

4.3.3 差异基因互作网络分析

4.3.4 qRT-PCR对转录组差异基因的验证结果

4.3.5 樱桃砧木响应干旱的代谢组分析结果

4.3.6 樱桃干旱响应的代谢物的鉴定

4.3.7差异基因和差异代谢物联合分析

4.3.8 樱桃砧木干旱响应核心候选基因筛选及其生物信息分析

4.4 讨论

4.4.1 樱桃砧木维持较强光合作用、保持能量平衡与抗旱性密切相关

4.4.2樱桃砧木响应干旱的次生代谢物分析

4.4.3樱桃砧木干旱条件下的激素响应分析

4.4.4樱桃砧木响应干旱的转录因子

4.5 小结

第五章 结论与创新点

5.1 总结

5.2 创新点

5.3 研究展望

附录

参考文献

致谢

个人简历