类病毒在栗疫病菌中的侵染、复制和传播

摘要

类病毒是一类共价闭合的环状单链RNA，不编码任何蛋白质，其基因组大小在246-434nt范围内。类病毒自身的稳定性强，不容易被脱氧核糖核酸酶降解。它是迄今发现最小的能进行自我复制的遗传因子。在自然界中，可引起十分严重的植物病害。 国际病毒分类委员会将目前已经鉴定的44种类病毒分为两个科，七个属。本实验中，选取了具有不同属代表性的7种类病毒，它们分别是：马铃薯纺锤形块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid)、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid)、血苋类病毒1号(Iresine viroid1)、苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid)、啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid)、桃潜花叶类病毒（Peach latent mosaic viroid）、鳄梨日斑类病毒（Avocado sunblotch viroid）。本研究所选用的丝状真菌为板栗疫病病原菌，该菌是属于子囊菌亚门、核菌纲、球壳菌目的寄生内座壳（Cryphenctria.Parasitica）。本课题主要研究类病毒能否侵染栗疫病菌并在栗疫病菌中进行复制。此外，研究类病毒的侵染对宿主真菌的生长，发育和致病性的影响。本实验为研究类病毒的宿主范围，发病机制和潜在的生物控制用途提供了新的研究思路和科学依据。 本实验首先构建七种类病毒的侵染性克隆，将类病毒的体外转录物通过机械摩擦侵染烟草检验其活性；并通过转化的方法侵染酵母菌株，验证类病毒是否能在酵母菌株中进行复制。通过原生质体转化的方法将类病毒体外转录物人工导入C.Parasitica原生质体细胞中，细胞再生后，在PDA培养基上筛选转化子，提取栗疫病菌ssRNA，设计特异性引物，利用RT-PCR技术对类病毒的侵染情况进行检测。观察稳定侵染的类病毒对寄主真菌的生长、发育及致病力的影响。主要的研究结果如下： 1.构建七种类病毒侵染性克隆：本实验利用体外转录的方法，构建了ASBVd HSVd IRVd PLMVd ASSVd IRVd CSVd七种类病毒的侵染性克隆质粒，获得体外转录类病毒RNA后，摩擦接种烟草检测其活性，并验证其是否能侵染酵母菌株AH109。 2.检测七种类病毒侵染丝状真菌的能力：将七种供试类病毒导入C.Parasitica原生质细胞后，利用RT-PCR技术检测发现：ASBVd、HSVd、IRVd能够在C.Parasitica中进行复制，其中类病毒ASBVd的复制相较其他两种类病毒更为稳定；ASBVd侵染的菌株经过继代培养后提取ssRNA进行RT-PCR检测，实验结果表明，ASBVd的复制量无明显减少，其他两种类病毒的复制量随继代次数的增加而逐步降低。 3.分析ASBVd侵染对C.Parasitica的影响：类病毒侵染后，对栗疫病菌表型产生一定影响，菌株的生长速率及色素积累量等发生变化。 4.分析ASBVd在真菌寄主中的传播情况：ASBVd侵染C.Parasitica后，与真菌病毒相似，可通过寄主菌丝融合进行传播。经RT-PCR检测证实，类病毒可从带毒菌株传播至无毒菌株；将ASBVd侵染的C.Parasitica置于光照下培养至菌株产孢后，进行单孢分离培养，提取真菌ssRNA并利用RT-PCR技术检测发现，类病毒可通过孢子进行传播。 5.分析ASBVd侵染真菌寄主后的遗传变异情况：类病毒侵染栗疫病菌后，将菌株继代培养，提取第8代菌株ssRNA进行检测并测序发现，随菌株继代培养后，类病毒序列发生了突变。 6.对比、分析ASBVd野生型与突变株系的侵染活力及对寄主真菌的影响：ASBVd突变株系侵染栗疫病菌后，菌株气生菌丝的量增加，生长力无明显变化，提取真菌ssRNA进行检测，结果表明，ASBVd的复制量与野生型中相比有所降低，侵染活力有所下降。

目录

第一章 文献综述

1.1类病毒研究进展

1.1.1类病毒的定义与结构

1.1.2类病毒的分类

1.1.3类病毒的复制

1.1.4类病毒的序列变异

1.1.5类病毒引起的病害症状

1.1.6类病毒在植物体内的传播

1.1.7植物抗类病毒的基因沉默途径

1.1.8类病毒的传播途径

1.1.9类病毒病害的防治

1.1.10国内外研究历史

1.2.1真菌病毒的定义

1.2.2真菌病毒的分类与传播

1.2.3真菌病毒对寄主真菌的影响

1.2.4植物病害生防中真菌病毒的应用

1.3本课题的研究目的与意义

第二章 类病毒侵染性克隆的构建

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3.1 实验试剂

2.3.2 实验仪器

2.4 实验方法

2.4.1类病毒侵染性克隆的构建

2.4.2 单倍克隆的构建

2.4.3 类病毒体外转录物的制备

2.4.4 类病毒体外转录物活性检测

2.5.1 类病毒侵染本氏烟的表型观察

2.7.2 类病毒侵染本氏烟的RT-PCR检测结果

2.6 讨论

第三章 七种类病毒体外转录物侵染酵母细胞

3.1 引言

3.2.1 病毒材料

3.2.2 酵母菌株

3.3 实验试剂

3.4 实验仪器

3.5.1 制备酵母感受态细胞

3.5.2转化

3.5.3 酵母细胞的培养

3.5.4 酵母细胞ssRNA的提取

3.5.5 RT-PCR检测类病毒的复制情况

3.6 实验结果

3.7 讨论

第四章 类病毒侵染丝状真菌的研究

4.1 引言

4.2.1 病毒材料

4.2.2栗疫病菌（Cryphonectria parasitic）

4.3 实验试剂

4.4 实验仪器

4.5 实验方法

4.5.1 栗疫病菌（C.parasitica）原生质体的制备

4.5.2 栗疫病菌（C.parasitica）原生质体转化

4.5.3 形态学观察类病毒对栗疫菌（C.parasitica）的影响

4.5.4 RT-PCR检测类病毒的复制情况

4.6 实验结果

4.6.1 类病毒侵染后栗疫病菌的表型

4.6.2 类病毒侵染栗疫病菌的RT-PCR检测

4.7 讨论

第五章 类病毒侵染丝状真菌后的遗传与变异

5.1 引言

5.2 实验材料

5.3 实验仪器与试剂

5.4 实验方法

5.4.1 类病毒侵染对栗疫病菌致病力的影响

5.4.2 类病毒在丝状真菌中的传播

5.4.3 类病毒突变体的制备

5.4.4 类病毒突变体的活性检测

5.4.5 类病毒突变体侵染栗疫病菌的检测

5.4.6 ASBVd在不同背景栗疫病菌株中的复制情况

5.5.1 类病毒侵染栗疫病菌的致病力分析

5.5.2 类病毒在栗疫病菌中复制稳定性的检测

5.5.3 类病毒突变体侵染栗疫病菌的检测

5.5.4 类病毒在栗疫病菌中的传播

5.5.5 类病毒侵染不同背景栗疫病菌株中的复制情况

5.6 讨论

第六章 类病毒在栗疫病菌中复制位点的研究

6.1 引言

6.2 实验材料

6.3.1 实验仪器

6.3.2 实验试剂

6.4 实验方法

6.4.1 栗疫病菌的细胞核质分离

6.4.2 RT-PCR检测细胞核质是否完全分离

6.4.3 RT-PCR验证类病毒ASBVd复制位点

6.4.4 栗疫病菌DdRP蛋白的原核表达

6.4.5 Western blot验证DdRP蛋白表达结果

6.5.5 ASBVd体外转录物与DdRP蛋白的体外结合

6.6 实验结果

6.6.1 RT-PCR检测类病毒ASBVd的复制位点

6.6.2 真菌DdRP蛋白原核表达与BSA定量结果

6.7 讨论

第七章 主要结论与展望

7.1本研究的主要结论

1. 类病毒侵染性克隆具有侵染活性

2. 类病毒可在酵母细胞中进行复制

3. 类病毒侵栗疫病菌后对其表型产生一定影响

4. ASBVd、HSVd、IRVd可侵染板栗疫病菌，在菌株中进行复制

5. 类病毒侵染栗疫病菌后发生变异

6. 类病毒可在栗疫病菌中进行传播

7.2 研究展望

参考文献

附录

致谢

个人简历