粉红聚端孢引致富士苹果心腐病的侵染特征及致病机制

摘要

苹果心腐病是一种苹果主要果实病害。可造成采前落果、果实心室腐烂和储藏期烂果等，严重影响苹果品质、降低苹果产量，给苹果种植者、经营者和消费者均带来较大的经济损失。在我国，粉红聚端孢是引起苹果心腐病的主要病原。心腐病主要发生于苹果心室开放品种。红富士属于心室半开放品种，在果实发育早期，心室封闭，随着果实膨大心室腔逐渐开放。在果实发育过程中，病原菌的侵染时间、侵染部位都不清楚，严重影响了针对性防治策略的制定。本论文拟研究我国心腐病的主要病原菌粉红聚端孢在主栽富士品种的侵染特征和致病机制，以期为苹果心腐病的防治及粉红聚端孢的致病机理提供理论依据。取得以下主要研究结果： 1.苹果心腐病为果实心室病害，果实的特殊结构造成病原菌侵入过程研究的困难性，本研究首先构建了PEG介导的粉红聚端孢遗传转化体系和绿色荧光标记菌株：通过液体培养基摇培粉红聚端孢获取幼嫩菌丝，用崩溃酶和裂解酶酶解幼嫩菌丝细胞壁制备原生质体，用PEG介导原生质体转化将携带博来霉素筛选标记和绿色荧光基因的质粒插入粉红聚端孢基因组获取有筛选抗性的转化子，通过筛选获得粉红聚端孢荧光标记菌株TR45。与野生型相比，该菌株菌落生长、产孢量和致病力均未发生明显改变，在不含筛选标记的培养皿中继代培养10代荧光仍能稳定表达，接种苹果组织后能观察到荧光亮度明显的侵染菌丝。可以作为进一步研究其基因功能及侵染特性的有效工具。 2.借助荧光标记菌株TR45，进行了粉红聚端孢对苹果不同花组织、萼筒、萼心间组织和心室内部的侵染和扩展特征研究，结果发现：粉红聚端孢可以侵染苹果花瓣、花药、花丝、柱头和离生花柱等花器组织，并在花器残体上繁殖产生菌丝和分生孢子。在花落后2周左右，随着萼片逐渐闭合，携带菌丝和孢子的花器残体被包裹到萼筒内。在花后3周可以观察到粉红聚端孢从合生花柱顶缝进入合生花柱，在花柱缝隙组织内扩展；进而在萼心间组织的延伸缝中扩展；在花后60天菌丝扩展至心室腔间组织；在花后100天随着萼窦逐渐扩大，萼窦、萼心间延伸缝和心室腔连通，菌丝进入心室腔；在心室腔内，菌丝在心室壁上扩展，从心室壁裂缝进入果肉组织。另外还发现，从花后60天以后到采收前，粉红聚端孢分生孢子在萼筒内不能萌发，推测其花后2个月不能再侵入花柱。这些结果表明：合生花柱顶部缝隙为粉红聚端孢侵入苹果主要关口，而要成功侵入苹果果肉组织还需要经过花柱缝隙、萼心间组织延伸缝、心室壁裂缝等通道，以及萼窦的开放。 3.除了侵染花器，粉红聚端孢侵染苹果萼洼处，在萼洼处形成的繁殖体也是心腐病潜在菌源。对粉红聚端孢在苹果表面侵染引起黑点病侵染特征研究发现：在蒸馏水中，12h分生孢子萌发率仅为2%，苹果汁溶液中萌发率提高到99%，在气孔、皮孔、微裂痕处的萌发率显著高于周围苹果表皮，表明苹果汁成分可以显著促进粉红聚端孢孢子萌发。在相对湿度95%条件下18h分生孢子萌发达到100%，显示粉红聚端孢侵染对湿度需求较低。粉红聚端孢不能直接穿透侵染苹果表皮，菌丝可以从气孔、皮孔、微裂痕等孔口处侵染。这些结果表明，果袋尤其是透气性差的膜袋所提供的微环境湿度使粉红聚端孢在苹果表面完成侵染循环比较容易满足，可以部分解释套袋后容易发生苹果黑点病的原因。黑点病主要发生在苹果萼洼处，黑点病的发生不但直接影响果实外观品质，而且可以为心腐病的发生提供菌源。 4.粉红聚端孢在侵染苹果果皮和果肉的组织时，菌丝仅在真皮细胞和薄壁细胞的细胞间隙扩展，显示粉红聚端孢具有孢间扩展特性，不能穿透寄主细胞壁；进一步观察发现，在花柱缝隙扩展过程中，菌丝不突破花柱缝的内表皮细胞，在萼心间延伸缝扩展，菌丝不突破延伸缝的细胞内壁，在心室腔中，菌丝只能从心室壁上的裂缝进入果肉细胞，支持粉红聚端孢不具备穿透寄主细胞壁的能力。这可能是粉红聚端孢在侵染过程中不直接造成果实腐烂，仅在进入果实心室内部后才导致发病，引致心腐病发生的主要原因。 5.对粉红聚端孢产生单端孢菌素（Tcin）的致病性作用及功能进行了研究，敲除粉红聚端孢合成通路的关键基因，单端孢烯合成酶基因（Tri5）并观察外源添加Tcin对致病的影响，发现不产Tcin的粉红聚端孢ΔTrTri5突变体在果实上完全失去致病力，互补Tri5基因使突变体单端孢菌素的合成能力回复后致病力也恢复，外源添加Tcin可以回复ΔTrTri5突变体的致病力；用少量Tcin（10μg/mL）处理苹果，此时果皮和果肉组织无明显症状，但与Tcin缺失突变体共同接种可以促进致病，说明单端孢菌素在粉红聚端孢的致病过程中起重要作用；用100μg/mL和500μg/mL单端孢菌素处理苹果后在苹果上不引起症状变化，但电镜观察发现，果肉细胞的质体内膜、外膜破裂、质体降解，细胞膜和液泡膜上有高密度电子密集物积累。这些结果显示，单端孢菌素具有植物毒素功能，单端孢菌素是粉红聚端孢致病过程中的关键致病因子。 本研究发现合生花柱顶端的自然孔口花柱顶缝是粉红聚端孢侵入苹果的关键部位，病菌入侵后沿花柱裂缝、延伸缝、萼窦、心室腔裂缝最后扩展果肉，导致心室果肉腐烂。明确单端孢菌素是植物毒素，为粉红聚端孢侵染苹果引致心腐病的关键致病因子。该研究对于靶向新农药设计、病原与寄主互作机制研究，及针对性病害防治策略制定具有理论及实践理论意义。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 粉红聚端孢引起的植物病害

1.2 苹果霉心病和心腐病

1.2.1 苹果霉心病和心腐病的发生与危害

1.2.2 苹果霉心病和心腐病的病原学研究

1.2.3 苹果霉心病和心腐病的侵染循环

1.2.4 果实结构对苹果霉心病和心腐病的影响

1.2.5 苹果霉心病和心腐病的防治概况

1.3 套袋苹果黑点病

1.3.1 果实套袋与黑点病发生关系

1.3.2 黑点病发生与危害

1.3.3 黑点病病原学研究

1.3.4 黑点病的发生规律

1.3.5 黑点病的防治

1.4.1 毒素

1.4.2毒素与植物致病关系

1.4.3毒素在植物致病中的作用机理

1.4.4 单端孢烯族毒素

1.4.5单端孢烯族毒素的危害

1.4.6 单端孢烯族毒素的合成基因和代谢通路

1.4.7 单端孢烯族毒素与真菌致病的关系

1.4.8 单端孢菌素

1.5 本研究的目的和意义

第二章 粉红聚端孢的原生质体制备和荧光标记菌株构建

2.1 引言

2.2.1 供试菌株

2.2.2 质粒

2.2.3 培养基和试剂

2.3.1 PEG介导的遗传转化

2.3.2 转化子荧光观察

2.3.3 转化子PCR检测

2.3.4 转化子的生物学特性和致病力分析

2.3.5 组织学观察

2.3.6 统计学分析

2.4 结果与分析

2.4.1 粉红聚端孢的遗传转化、PCR验证和荧光信号观察

2.4.2 荧光标记转化子的生物学特性和致病力评价

2.4.3 组织学观察

2.5 结论与讨论

第三章 粉红聚端孢引起的苹果心腐病侵染特征研究

3.1 前言

3.2 试验材料

3.3 方法

3.3.1 离体花器接种

3.3.2 田间接种

3.3.3 透射电镜观察受侵染的果肉细胞

3.4 结果与分析

3.4.1 粉红聚端孢侵染花器组织观察

3.4.2 粉红聚端孢侵染花器残体及在萼筒中扩展观察

3.4.3 粉红聚端孢侵染花柱及在花柱中扩展

3.4.4 粉红聚端孢在苹果萼心间组织中扩展

3.4.5 粉红聚端孢侵染苹果心室过程

3.4.6 粉红聚端孢在苹果内部通道扩展原因分析

3.4.7 粉红聚端孢引起的苹果心腐症状发生于苹果成熟时期

3.4.8 粉红聚端孢的侵染时期研究

3.4.9 细胞学观察

3.5 结论与讨论

第四章 粉红聚端孢引起的苹果黑点病发生规律研究

4.1 引言

4.2 试验材料

4.3 方法

4.3.1粉红聚端孢孢子悬浮液制备

4.3.2 苹果果肉提取液制备

4.3.3 离体条件下外源营养、湿度和光照对孢子萌发的影响

4.3.4 室内接种观察侵染点

4.3.5 扫描电子显微镜观察

4.3.6 透射电镜样品制备与观察

4.3.7 田间接种和荧光观察

4.3.8 数据分析

4.4 结果

4.4.1 外源营养、相对湿度和光照对粉红聚端孢孢子萌发的影响

4.4.2 粉红聚端孢在苹果表面上的侵染位点

4.4.3 粉红聚端孢在苹果表皮组织内的扩展特点

4.4.4 粉红聚端孢在田间的侵染时间和发病情况

4.4.5 田间不同生长期果实被侵染后产生的组织学变化

4.5 结论与讨论

第五章 单端孢菌素在粉红聚端孢致病中作用机制研究

5.1 引言

5.2 试验材料

5.3.1 TrTri5基因的敲除

5.3.2 ΔTrTri5突变体的互补

5.3.3ΔTrTri5突变体的表型分析和对胁迫的反应

5.3.4 GC–MS检测腐烂果肉中的有机物

5.3.5 真菌培养液中单端孢菌素的测定

5.3.6 粉红聚端孢侵染后的腐烂果肉中单端孢菌素含量测定

5.3.7 致病力试验

5.3.8 单端孢菌素对粉红聚端孢野生型和ΔTrTri5突变体孢子萌发的影响

5.3.9 野生型和ΔTrTri5突变体培养滤液提取物对粉红聚端孢致病的影响

5.3.10 单端孢菌素对野生型和ΔTrTri5突变体致病的影响

5.3.11 单端孢菌素对苹果组织和果肉细胞的影响

5.3.12 透射电镜样品制备与观察

5.3.13 数据统计与分析

5.4 结果与分析

5.4.1 苹果果实腐烂组织的单端孢菌素检测

5.4.2 粉红聚端孢编码单端孢烯合成酶TrTri5基因的敲除和互补

5.4.3 TrTri5基因缺失影响粉红聚端孢中单端孢菌素的合成

5.4.4 ΔTrTri5突变体的培养滤液对丝状真菌生长的影响

5.4.5 单端孢菌素在腐烂果肉和周围无症状组织中的含量比较

5.4.6ΔTrTri5突变体的生长表型分析

5.4.7 粉红聚端孢TrTri5基因在侵染苹果果实过程中作用

5.4.8 粉红聚端孢TrTri5基因的表达和定位

5.4.9 野生型和ΔTrTri5突变体培养滤液提取物对粉红聚端孢致病的影响

5.4.10 单端孢菌素对粉红聚端孢野生型和ΔTrTri5突变体生长的影响

5.4.11 单端孢菌素能够促进野生型菌株的致病性

5.4.12 单端孢菌素能够回复ΔTrTri5突变体的致病力

5.4.13 单端孢菌素对苹果果皮和果肉组织的影响

5.5 结论与讨论

第六章 全文总结

参考文献

致谢

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