GhCML41蛋白调控棉花抗黄萎病的分子机制

摘要

棉花黄萎病是棉花生产上最具有毁灭性的病害之一，在我国主产棉区常年发生，严重威胁着我国棉花产业的可持续发展，科学研究与生产实践证明，种植抗病品种是最经济有效的防控途径。本研究前期蛋白质组学分析结果表明，接种大丽轮枝菌Vd080棉花植株的GhCML41蛋白发生了明显的磷酸化，且抗病品种上的磷酸化水平是感病品种上的1.5倍，未接菌对照棉花上则没有发生磷酸化，初步推测GhCML41参与了棉花对黄萎病抗病过程。为进一步解析GhCML41蛋白在棉花抗黄萎病中的作用，本研究以抗性品种中植棉2号和感病品种冀棉11号为试材，接种大丽轮枝菌Vd080，采用生物学、分子生物学以及细胞生物学等方法，对GhCML41蛋白调控的棉花抗黄萎病的分子机制进行了研究，以期为利用基因工程技术培育抗黄萎病棉花品种提供理论依据。主要取得以下结果： 1.克隆了棉花GhCML41基因，全长为606bp，编码201个氨基酸，蛋白质结构预测发现其仅含有4个EF-hands结构，含有α-螺旋、延伸链和无规则卷曲。序列同源比对显示GhCML41与拟南芥AtCML41亲缘关系最近。 2.GhCML41基因实时定量分析表明，抗病品种中植棉2号接种Vd080菌株3h后，基因表达量为未接种菌植株的26.85倍；抗病品种中植棉2号和感病品种冀棉11号同时接种Vd080菌株6h后，基因在抗病品种中的表达水平为感病品种的7.23倍。 3.利用VIGS技术沉默GhCML41基因后，接种Vd080菌株，对照和基因沉默植株的病株率分别为59.01%和87.5%，病情指数分别为22.73和45.31。同时，发现基因沉默植株叶片的木质素合成能力减弱、胼胝质沉积能力下降、水杨酸含量降低、茉莉酸含量升高、防御基因PAL、POD、PPO、C4H1、PR1和NOA1的表达量下调。 4.转GhCML41基因拟南芥较野生型发病轻，其具体的抗病机制，还需要进一步研究。亚细胞定位结果显示，GhCML41定位在细胞核与细胞膜。 5.KEGG信号通路分析结果表明，GhCML41、CDPK28以及RBOHD三个基因通过调控NO和H2O2的含量来增强植物的防御反应。分别沉默三个基因后，接种Vd080菌株，发现沉默植株的病情指数显著高于对照。同时，GhCML41基因沉默植株NO的含量明显少于对照植株，并且在接菌12h时，下降幅度最大，达到71.98%；而CDPK28和RBOHD沉默植株的NO含量则高于对照植株。此外，在接菌3h时，GhCML41基因沉默植株的H2O2含量相较对照显著增加，而CDPK28和RBOHD基因沉默植株的H2O2含量相较对照明则显著降低。

目录

声明

英文缩略表

第一章 文献综述

1.1 棉花黄萎病概述

1.2植物的防御反应

1.3 钙信号

1.4 植物中的钙传感蛋白

1.5 植物类钙调素蛋白（CMLs）

1.5.1 CMLs基因的表达特点

1.5.2 CMLs在植物抗逆中的功能

1.6 本研究的目的及意义

第二章 中植棉GhCML41基因的克隆及序列分析

2.1 材料

2.1.1 植物材料及引物

2.2.2 主要试剂及仪器

2.2 方法

2.2.1 棉花总RNA的提取

2.2.2 cDNA的合成

2.2.3 目的基因的克隆

2.2.4 目的片段回收、连接、转化

2.2.5 序列分析

2.3 结果分析

2.3.1 GhCML41基因的克隆

2.3.2 GhCML41基因序列及结构分析

2.4讨论

第三章 GhCML41功能初步验证

3.1 材料

3.1.1 植物材料及引物

3.1.2 主要试剂及仪器

3.2 方法

3.3 结果分析

3.4讨论

第四章 GhCML41在棉花中的抗病机制

4.1 材料

4.1.1 植物材料

4.1.2 主要试剂及仪器

4.2 方法

4.2.1 VIGS载体的构建

4.2.2 沉默载体注射棉花

4.2.3 接种大丽轮枝菌

4.2.4 病情指数的调查

4.2.5 植株木质化检测

4.2.6 植株叶片细胞胼胝质检测

4.2.7 水杨酸含量测定

4.2.8 茉莉酸含量测定

4.2.9 防御基因检测

4.3 结果分析

4.3.1 VIGS载体构建

4.3.2 抗病检测

4.3.3 植物木质部染色情况

4.3.4 植物叶片细胞胼胝质染色情况

4.3.5 植物叶片水杨酸含量测定

4.3.6 植物叶片茉莉酸含量测定

4.3.7 防御基因检测

4.4 讨论

第五章 GhCML41蛋白亚细胞定位

5.1 材料

5.1.1 植物材料及引物

5.1.2 主要试剂及仪器

5.2 方法

5.2.2 GFP-GhCML41的载体构建

5.2.3 GhCML41的亚细胞定位

5.3 结果分析

5.3.1 GhCML4-GFP载体的构建

5.3.2 GhCML41的亚细胞定位

5.4讨论

第六章 转GhCML41拟南芥的获得以及抗病性检测

6.1 材料

6.1.1 植物材料与引物

6.1.2 主要试剂及仪器

6.2 方法

6.2.1植物过表达载体的构建

6.2.2拟南芥种子消毒及种植

6.2.3蘸花法转化拟南芥植株

6.2.4转GhCML41拟南芥的功能验证

6.3.1 植物过表达载体构建

6.3.2 转基因拟南芥的筛选

6.3.3 抗病性检测

6.4讨论

第七章 GhCML41、CDPK28及RBOHD协同调控NO和H2O2

7.1 材料

7.1.1 植物材料

7.1.2 主要试剂及仪器

7.2 方法

7.2.1 CDPK28及RBOHD基因VIGS载体的构建

7.2.2 植株病情指数调查

7.2.3 植物叶片NO含量测定

7.2.4 植物叶片H2O2含量测定

7.3 结果分析

7.3.1 KEGG信号通路分析结果

7.3.2 CDPK28及RBOHD基因VIGS载体构建

7.3.3 植株病情调查

7.3.4 植物叶片NO含量测定

7.3.5 植物叶片H2O2含量测定

7.4讨论

第八章 结论与展望

8.1 结论

8.2 展望

参考文献

致谢

个人简历