与猪瘟病毒NS5B蛋白互作的宿主蛋白galectin-1对猪瘟病毒复制的影响

摘要

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种猪的流行性疾病。该病的典型临床症状为高热，组织器官出血、阻塞和坏死，周身多发性小出血点，繁殖障碍等。CSFV是一种单股正链RNA病毒，NS5B蛋白是CSFV的非结构蛋白，它具有依赖于RNA的RNA聚合酶活性（RNA dependent RNA polymerase,RdRp），在病毒复制的过程中发挥重要作用。研究NS5B蛋白和宿主细胞蛋白之间的相互作用，可以为了解CSFV的感染，认识NS5B蛋白在其感染过程中发挥的作用提供有效工具。在实验室前期的研究中，用含有CSFV NS5B基因构建的诱饵质粒与猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophages,PAM）cDNA文库进行酵母双杂交，成功筛选到了与CSFV NS5B蛋白相互作用的半乳糖凝集素-1（Lectin galactoside-binding soluble1,LGALS1/galectin-1）。galectin-1在细胞内和细胞外都具有很多功能，比如在机体内诱导细胞凋亡，通过调节炎症发生及免疫反应等来抵御外界病原微生物的入侵，还可以影响肿瘤的发生、细胞的黏附、细胞之间信号的转导等。galectin-1可以通过与蛋白或多糖之间相互影响来发挥其功能。 本研究通过将CSFV NS5B基因片段克隆含有冷启动子的pCold-SUMO原核表达载体构建了重组质粒，转化Rosetta（DE3）大肠杆菌表达菌，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，成功地将重组蛋白在上清中表达。采用镍柱亲和层析法（Ni-NTA）进行纯化以获得纯度较高的蛋白，纯化得到的蛋白免疫小鼠以制备抗NS5B的多克隆抗体，通过蛋白免疫印迹（Western blot）验证所制备多克隆抗体的反应性和特异性。发现制备的多克隆抗体可以与原核表达及真核质粒转染瞬时表达的NS5B蛋白发生反应，即通过Western blot可以检测到特异性条带，但与CSFV感染PK-15细胞后裂解所得的天然构象的NS5B蛋白不能发生特异性反应。 研究发现CSFV感染的宿主细胞中galectin-1在转录水平（mRNA）和蛋白水平均出现下调。通过分别构建了galectin-1过表达和干扰稳定转染细胞系，接种CSFV后利用实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative PCR,RT-qPCR）和间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）对CSFV的转录水平及释放到上清中的病毒滴度水平进行检测。发现干扰PK-15细胞中galectin-1基因的表达可以上调CSFV的转录，过表达galectin-1蛋白下调了CSFV的转录和上清中的病毒滴度，即galectin-1具有抑制CSFV复制的生物学活性，可以为以后研发抗CSFV药物提供新的理论依据。

目录

声明

主要符号对照表

文献综述

第一章 猪瘟病毒及galectin-1蛋白的研究进展

1.1 猪瘟的病原学

1.2 CSFV的分子生物学特征

1.3 NS5B蛋白的研究进展

1.4 galectin-1蛋白的研究进展

1.5 本研究的目的及意义

试验研究

第二章 猪瘟病毒NS5B蛋白多克隆抗体的制备

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 galectin-1蛋白对猪瘟病毒复制的影响

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

结论

参考文献

致谢

个人简历