PRMT1介导的细胞外基质沉积及维生素D3的缓解机制研究

摘要

慢性呼吸道病已成为家禽的一种主要传染病，感染后导致雏鸡的弱雏率增加，蛋鸡的产蛋率、种蛋的受精率和孵化率均显著下降，肉鸡出现呼吸系统的病理损伤，从而引起料肉比升高，生产性能下降。由于疫苗和抗生素对家禽慢性呼吸道病的防治效果不佳，给养鸡业带来巨大的经济损失。细胞外基质结构发生改变不仅会加强病原体的感染，还会引起气道重塑，导致疾病恶化。蛋白质精氨酸甲基化作为一种表观遗传修饰，主要由蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）负责，可以根据细胞环境激活或抑制基因表达，可能调控细胞外基质结构的改变，参与肺部炎症疾病的发生过程。因此本试验在肺部成纤维细胞体外培养的技术平台上，探究维生素D3缓解肺部慢性炎症发生过程中PRMT1介导的细胞外基质沉积研究，为治疗家禽慢性呼吸道疾病提供有效的分子靶点和方式。本试验包括三部分： 试验一PRMTs在成纤维细胞胶原蛋白沉积中的作用 用胸腺基质淋巴生成素（TSLP）刺激成纤维细胞（0、6、12、24和48h）后，成纤维细胞的TSLP受体mRNA水平表达升高（P<0.01）；且上调了Ⅰ型胶原蛋白（COL1A1）的mRNA（P<0.01）和蛋白表达（P<0.05）；但成纤维细胞中的Ⅲ型胶原蛋白（COL3A1）表达不受TSLP处理影响（P>0.05）。PRMTs家族中的PRMT1和PRMT6随着TSLP刺激时间的延长表达量增加（P<0.01），一直持续到48h；PRMT4和PRMT7在TSLP刺激12h后升高（P<0.05），在24h时表达快速下降；而PRMT5（P<0.01）和PRMT9（P<0.05）在12h后表达上调，能持续到24h，但48h时表达无显著差异。可见PRMT4、PRMT5、PRMT7和PRMT9可能在TSLP刺激的2h内发挥调控作用。此外，PRMT2、PRMT3和PRMT8的表达无显著差异。进一步检测了PRMT1的蛋白表达，发现PRMT1在TSLP的诱导下mRNA和蛋白表达均升高且呈时间依赖（P<0.01）。加入siRNA干扰PRMT1表达后，COL1A1的蛋白表达降低（P<0.05）；在成纤维细胞中转染PRMT1质粒后，发现过表达PRMT1能够升高COL1A1的蛋白表达。这些结果表明TSLP处理成纤维细胞后能够通过与TSLP受体结合诱导Ⅰ型胶原蛋白沉积，蛋白质精氨酸甲基化修饰参与胶原蛋白沉积过程，其中PRMT1可以调控胶原蛋白的表达。 试验二肺部慢性炎症发生过程中成纤维细胞胶原蛋白沉积的分子机制 本试验在试验一基础上，检测了TSLP刺激成纤维细胞不同时间点（0、6、12、24和48h），主要降解I型间质胶原的酶（MMP1）的表达，发现MMP1的mRNA和蛋白表达上调（P<0.01）。且MMP1的mRNA水平从TSLP刺激6h后开始上调，一直持续至48h；蛋白水平从12h后开始上调维持48h。此外，成纤维细胞中的MMP2的表达不受TSLP影响（P>0.05）。在TSLP刺激前2h加入了PRMTs酶活抑制剂（AMI-1），发现下调了MMP1的mRNA水平（P<0.01），但是PRMT1和MMP1的蛋白表达均不受PRMTs酶活抑制剂的影响。进一步使用siRNA干扰PRMT1的表达后，结果显示10nM和20nM si-PRMT1能完全抑制MMP1表达，与AMI-1处理相同；此外，用PRMT1过表达质粒转染细胞后，观察到MMP1又随着PRMT1的表达升高而升高。用10ng/mLTSLP刺激成纤维细胞5min、15min、30min、1h和3h后，结果显示STAT3在TSLP刺激30min后被磷酸化，且在TSLP刺激1h后消失；且ERK1/2在TSLP刺激5min后发生磷酸化（P<0.05），早于STAT3。同时，还使用了STAT3的抑制剂S3I-201去阻断STAT3的磷酸化，发现10μM的S3I-201可以抑制PRMT1和MMP1的mRNA和蛋白表达（P<0.05）。抑制ERK1/2通路后，PRMT1和MMP1的蛋白表达均降低，。这些发现表明MMP1参与胶原蛋白沉积过程，且PRMT1可以直接调控MMP1的表达，TSLP通过激活ERK1/2-STAT3通路上调成纤维细胞中PRMT1和MMP1表达。 试验三补充维生素D3对成纤维细胞胶原蛋白沉积的影响 为了进一步研究持续补充维生素D3对成纤维细胞产生胶原蛋白的影响。将10nM的维生素D3活性成分（Calcitriol）加入培养基中持续培养细胞3代后，换无血清培养基时去除Calcitriol，加入TSLP刺激成纤维细胞0、5min、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h和48h，发现STAT3的磷酸化水平在5min后开始下降，紧跟着ERK的表达在15min后开始被抑制，一直持续到3h。随着刺激时间的延长，在TSLP持续处理6h后，PRMT1的表达下降，12h后表达恢复；MMP1前体和COL1A1的表达在6h后表达下降，持续至24h。这些发现说明持续提前补充维生素D对TSLP诱导的胶原蛋白沉积具有保护作用。 综上所述，发现胶原蛋白沉积的一种新信号机制。在肺成纤维细胞中，TSLP刺激后，通过与细胞TSLP受体结合，激活ERK1/2-STAT3通路，上调PRMT1和MMP1的表达，进而调控胶原蛋白沉积过程。此外，维生素D3的持续提前补充能够通过降低STAT3的磷酸化缓解胶原蛋白沉积。可见，PRMT1和维生素D3在胶原蛋白沉积过程中都发挥着关键作用。这些发现为治疗慢性呼吸道疾病提供了有效的分子靶点和方式。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 家禽慢性呼吸道疾病概述

1.2 细胞外基质结构

1.3 蛋白质精氨酸甲基化

1.4 维生素D

1.5 研究问题的提出与研究内容

第二章 PRMTs在成纤维细胞胶原蛋白沉积中的作用

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 肺部慢性炎症发生过程中成纤维细胞胶原蛋白沉积的分子机制

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 补充维生素D3对成纤维细胞中胶原蛋白沉积的影响

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 小结

第五章 总体结论与建议

5.1 本研究的主要结论

5.2 本研究创新点

5.3 有待进一步研究的问题

附录

参考文献

致谢

作者简介