猪圆环病毒2型ORF5蛋白诱导PK-15细胞自噬通路及细胞自噬对病毒复制的影响

摘要

猪圆环病毒2型（PCV2）是猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原，可引起感染猪淋巴细胞的损害而导致机体免疫抑制，继发和混合多种病原的感染，诱发多种感染和疾病的发生，严重损害猪的健康和影响养猪业发展。PCV2为DNA病毒，基因组由1766~1768个核苷酸组成，基因组结构为闭合的环状单股负链DNA。对PCV2致病机理阐明是更好防控病毒感染和疾病发生的基础，对病毒编码蛋白的功能解析是研究其致病机理的重要方面。在PCV2基因组中存在多个开放阅读框（ORF），编码产物在病毒感染和致病中发挥一定的作用。目前已经鉴定的有6个ORFs，对其编码蛋白在PCV2感染中的作用进行了研究，ORF5为本研究团队鉴定的一个新的编码PCV2非结构蛋白的基因，研究发现ORF5蛋白可以影响细胞周期、诱导细胞内质网应激（ERS）、细胞自噬和促进病毒的复制。细胞ERS和自噬在病毒感染中具有重要作用，诱导细胞自噬的信号通路众多，其中内质网应激—细胞自噬是一条重要的调控通路。前期研究发现了ORF5蛋白可诱导宿主细胞ERS和自噬发生，阻断ERS后细胞自噬作用也被下调，推测ORF5蛋白诱导的细胞自噬和ERS的发生相关。对ORF5蛋白诱导细胞自噬的通路鉴定以及细胞自噬对PCV2复制影响的研究，将为ORF5蛋白诱导细胞自噬机制和在病毒感染中的作用研究提供新的资料。本研究以PK-15细胞为研究对象，开展了ORF5蛋白诱导细胞自噬主要通路的鉴定，对诱导的细胞自噬影响病毒复制作用进行了研究。本研究获得了以下结果： （1）ORF5蛋白诱导PK-15细胞自噬。将PCV2和PCV2 ORF5（ORF5基因突变株）病毒株分别感染PK-15细胞，以重组表达质粒pEGFP-ORF5转染PK-15细胞。通过激光共聚焦显微镜观察到ORF5蛋白的表达使细胞自噬标记蛋白LC3由分散状态转变为斑点聚集，提示细胞出现自噬；Western blot检测发现LC3II蛋白的含量升高，说明LC3I蛋白被切割为LC3II蛋白，诱导了细胞自噬；用细胞内质网应激抑制剂（4-PBA）抑制内质网应激后LC3II/LC3I的比值下降，细胞中LC3蛋白荧光斑点减少，说明抑制内质网应激后细胞自噬作用被下调。研究结果说明ORF5蛋白诱导了PK-15细胞自噬，内质网应激是诱发细胞自噬的途径之一。 （2）细胞自噬促进PCV2在PK-15细胞内的复制。通过绘制PCV2和PCV2?ORF5病毒株在PK-15细胞内的生长曲线，发现在病毒感染细胞48h内PCV2?ORF5毒株的DNA拷贝数明显低于PCV2试验组（P<0.01）；同时PCV2 ORF5毒株感染细胞后Cyclin A在核酸和蛋白水平均被上调，提示ORF5蛋白使细胞周期延长，利于病毒复制；在PCV2感染的PK-15细胞再转染pEGFP-ORF5重组质粒，发现PCV2Cap蛋白的mRNA和蛋白表达均增加，抑制内质网应激后Cap蛋白的mRNA和蛋白表达均出现下降。说明病毒和ORF5蛋白诱导的细胞自噬促进了PCV2复制。 （3）ORF5蛋白通过PERK-eIF2α-ATF4和mTOR-ERK1/2-AMPK诱导PK-15细胞自噬。对转染pEGFP-ORF5重组质粒的PK-15细胞中PERK信号通路和mTOR信号通路管件接头蛋白进行检测。结果表明，ORF5蛋白上调了PERK蛋白的磷酸化水平，激活通路下游效应因子eIF2α/ATF4的表达，促进了LC3I切割为LC3II蛋白；通过加入通路抑制剂后，PERK蛋白的磷酸化、eIF2α和ATF4蛋白水平、LC3II的含量均降低。表达ORF5蛋白的PK-15细胞的mTOR蛋白磷酸化被抑制，其通路下游ERK1/2-AMPK蛋白磷酸化水平升高，检测发现LC3II蛋白的含量也升高，说明mTOR-ERK1/2-AMPK信号通路被活化和细胞自噬的发生；分别用U0126和Compound C试剂抑制细胞ERK1/2和AMPK蛋白磷酸化后，mTOR蛋白的磷酸化增加，LC3II蛋白含量下降，细胞自噬被抑制。本研究结果表明，ORF5蛋白促进了PK-15细胞PERK-eIF2α-ATF4和mTOR-ERK1/2-AMPK信号通路的激活，诱导细胞自噬。 （4）PERK-eIF2α-ATF4和mTOR-ERK1/2-AMPK信号通路的激活促进PCV2的复制。将重组质粒pEGFP-ORF5转染PK-15细胞，然后分别感染PCV2和PCV2 ORF5病毒株。研究发现ORF5蛋白使Cap蛋白的mRNA和蛋白表达均增加。加入通路抑制剂后，PERK、ERK1/2和AMPK的磷酸化被抑制，Cap蛋白的mRNA和蛋白表达下降，Rapa抑制mTOR的磷酸表达后促进了PCV2的复制。说明病毒和ORF5蛋白可以通过PERK-eIF2α-ATF4和mTOR-ERK1/2-AMPK通路促进PCV2复制。 本研究结果表明，PCV2ORF5蛋白主要通过激活PERK-eIF2α-ATF4和mTOR-ERK1/2-AMPK信号通路诱导PK-15细胞自噬，促进PCV2的复制。

目录

主要符号对照表

第一章 猪圆环病毒2型及细胞自噬与病毒感染研究进展

1.1.1 猪圆环病毒的发现和分类

1.1.2 PCV2的危害与特征

1.1.3 PCV2编码蛋白及功能

1.1.4 PCV2的复制增殖及致病机制

1.2.1 细胞自噬研究进展

1.2.2 细胞自噬的调控信号通路

1.2.3 病毒感染与细胞自噬

1.2.4 PCV2感染与细胞自噬

1.3 本研究的目的和意义

第二章 PCV2 ORF5蛋白诱导细胞自噬研究及细胞自噬对病毒复制的影响

2.1 材料

2.1.1 细胞、菌株和质粒

2.1.2 主要试剂、抗体及试剂盒

2.1.3 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 试剂配制

2.2.2 引物设计与合成

2.2.3 PCV2克隆毒株和ORF5基因突变株PCV2?ORF5的构建

2.2.4 PCV2克隆毒株和PCV2?ORF5突变毒株的获得

2.2.5 PCV2 Cap基因的克隆和荧光定量PCR标准曲线的建立

2.2.7 PCV2与PCV2?ORF5毒株对PK-15细胞周期蛋白CyclinA表达的影响

2.2.8 细胞自噬标志蛋白LC3的检测

2.2.9 激光共聚焦显微镜观察表达ORF5的细胞中LC3的分布

2.2.10 ORF5蛋白对PCV2复制的影响

2.3.1 PCV2全基因的克隆和重组质粒构建

2.3.2 PCV2克隆毒株与PCV2?ORF5毒株的鉴定

2.3.3 PCV2 Cap基因qPCR建立标准曲线

2.3.4 PCV2与PCV2?ORF5病毒在PK-15细胞中的复制曲线

2.3.5 ORF5蛋白对宿主细胞Cyclin A表达的影响

2.3.6 ORF5蛋白对宿主细胞自噬的影响

2.3.7 ORF5蛋白对自噬标志蛋白LC3在细胞内分布的影响

2.3.8 ORF5蛋白诱导的细胞自噬对PCV2复制的影响

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 ORF5蛋白诱导宿主细胞自噬的信号通路及对病毒复制的影响

3.1 材料

3.1.1 细胞、菌株和质粒

3.1.2 试剂、抗体和主要仪器设备

3.2 方法

3.2.1 设计引物

3.2.2 应用于细胞试验的各化学试剂使用浓度筛选

3.2.3 ORF5蛋白对PERK-eIF2α-ATF4通路的影响

3.2.4 PERK-eIF2α-ATF4信号通路对PCV2复制的影响

3.2.5 ORF5蛋白对mTOR-ERK1/2-AMPK通路的影响

3.2.6 PERK和mTOR通路对ORF5蛋白诱导的LC3细胞分布的影响

3.2.7 mTOR-ERK1/2-AMPK信号通路对PCV2复制的影响

3.3 结果

3.3.1 所用化学试剂最佳使用浓度确定

3.3.2 ORF5蛋白激活PERK-eIF2α-ATF4通路诱导细胞自噬

3.3.3 ORF5蛋白激活PERK-eIF2α-ATF4通路后促进病毒复制

3.3.4 ORF5蛋白激活mTOR-ERK1/2-AMPK通路诱导细胞自噬

3.3.5 PERK和mTOR通路激活/抑制后LC3蛋白在细胞内的分布变化

3.3.6 ORF5蛋白激活mTOR-ERK1/2-AMPK通路促进PCV2复制

3.4 讨论

3.5 小结

结论

参考文献

附录

致谢

个人简历