抗体可变区稳定性评价模式的建立及初步应用

摘要

近年来,基因工程抗体在世界医药市场异军突起,已成为世界生物工程制药业的支柱产品之一。与其它生物药物不同,抗体在成为药物之前需要进行改造。然而,抗体改造过程中其稳定性的改变成为制约抗体发展的瓶颈。一系列的研究表明,抗体的可变区是影响抗体稳定性的关键因素,可变区结构的稳定优化已经成为重组抗体研发的关键步骤。
　　随着结构生物学、生物信息学、计算机科学的迅速发展,借助已有的蛋白质结构信息,通过热力学参数(焓、熵、自由能等)对蛋白-蛋白相互作用进行探讨,分析其界面特征,从理论上对蛋白-蛋白作用复合物的稳定性进行分析。
　　在本研究中,利用建立的抗体可变区序列、结构信息数据库,通过序列比对、结构模拟及优化、距离几何学、分子间氢键形成理论、结合能计算,从理论上探讨影响抗体可变区稳定性的关键因素,为抗体分子稳定性的改造提供理论依据。具体完成工作如下:
　　抗体可变区序列、结构信息数据库的构建——基于生物信息学技术,广泛收集网络数据库(Kabat、IMGT、PDB、Swiss Prot等)中的小鼠、人抗体可变区序列信息,利用计算机编程技术(JAVA语言),实现从核酸碱基序列到蛋白质氨基酸序列的翻译,并遵循Kabat、Chothia、AbM判别模式,对抗体可变区序列进行框架区(FR区)和高变区(CDR区)的划分与标注。基于此,建立抗体可变区的序列信息数据库。利用多序列比对ClustalW方法,对获得的不同亚类人抗体可变区序列进行聚类分析,确定人抗体可变区的位置氨基酸的使用频率,为深入探讨人抗体稳定性以及人源化改造奠定基础。
　　利用建立的抗体可变区序列信息数据库,结合蛋白质结构数据库(PDB)收集小鼠、人抗体可变区的结构信息,通过计算机辅助分子模拟技术对抗体可变区构象进行合理优化,确定的稳定构象以及抗体轻、重链可变区单体构象共同存储于本地的抗体可变区结构信息数据库中。进而结合计算机图形学技术、拓扑学方法对抗体可变区的二级结构进行分析,获得的二级结构拓扑图也保存在结构信息数据库中。
　　影响抗体可变区稳定性的关键因素——利用建立的抗体可变区序列、结构信息数据库,基于分子间氢键形成理论、反应自由能理论从热力学、动力学对抗体分子轻、重链可变区相互作用的动态结构及能量特征进行探讨;借助统计学原理、非线性拟合、回归分析等分析手段对抗体轻、重链作用能与其构象特征、理化性质建立相关性分析。通过分子模拟与统计学分析,抗体的轻重链可变区结合能与其轻重链间的氢键形成数目、范德华作用均存在线性相关性;与抗体理化性质存在多项式相关性。
　　基于位置氨基酸的使用频率以及建立的分析模型,针对无法获得稳定工程细胞株的抗Ricin人源化功能抗体进行合理的评价及优化,通过计算机分子模拟技术设计抗Ricin人源化功能抗体突变体,合理指导实验,并获得抗Ricin人源化抗体稳定的工程细胞株。
　　抗体可变区的自身结构(构象、理化性质)对其稳定性有很大影响,可以通过抗体结构优化来提高抗体的稳定性。

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前言

第1章 抗体可变区序列信息收集及初步分析

第一节 抗体可变区序列的收集及标注

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第二节 抗体可变区序列的聚类分析

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

小结

第2章 影响抗体可变区稳定性结构因素初步探讨

第一节 抗体结构信息数据库的构建及抗体可变区结合能的计算

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第二节 范德华作用和氢键作用的计算

1实验材料

2实验方法

3结果

4讨论

第三节 抗体可变区的接触面积分析

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第四节 影响抗体可变区稳定性关键因素的确认

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第五节 基于抗体Fv稳定性的关键因素判别、优化抗蓖麻毒素抗体MIL33

1材料方法

2结果

3讨论

小结

总结

参考文献

文献综述

个人简历

致谢