VASN蛋白作为肝癌血清标志物及治疗靶标的研究

摘要

肝癌是一种常见的恶性肿瘤,据报道,世界范围内每年新增肝细胞癌患者达到700,000以上。中国是全球肝癌发病率最高的国家,有统计显示,我国肝癌发病人数占全球55％,死亡人数占全球45%,列癌症死亡的第二位,而且发病率不断上升。肝细胞癌的早期发现、早期诊断、早期治疗对肝癌患者的预后和存活时间至关重要。甲胎蛋白是迄今人类发现的第一个具有诊断价值的肿瘤标志物,在肝癌普查、早期诊断、疗效判定和预后评价等方面发挥了重要作用。但临床上约有30%～40%肝癌患者血清甲胎蛋白阴性,且近年来又有增多的趋势。这部分肝癌患者缺乏有效的肿瘤标志物用于辅助诊断、预后判断与疗效评价。因此,寻找新的肝癌的血清标志物,尤其与预后相关的标志物具有重要的意义。我们的研究主要基于利用SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)技术发现新的肝癌标志物,并对标志物分子的地位、作用进行了研究,主要分为四个部分:
　　第一部分:肝癌血清标志物的获得与鉴定
　　利用液相SELEX技术,我们实验室以伴肝外转移的AFP(Alpha-fetoprotein)阴性HCC(hepatocellular carcinoma)患者血清为靶标,以正常人血清为消减靶标,经过5轮结合、消减筛选,获得了特异识别肝癌患者血清的富集ssDNA文库;然后,利用凝胶阻滞的方法,从与富集ssDNA(single stranded DNA)文库结合的蛋白中鉴定出候选靶蛋白,VASN(vasorin,slit like 2)蛋白。首先对VASN蛋白在血清标本、肿瘤细胞、肿瘤组织中的表达水平进行了研究,对VASN的标志物地位进行了评价。结果发现肝癌患者血清中的VASN蛋白水平高于正常人,且与AFP无明显相关性,提示VASN可以和AFP联合应用来提高辅助诊断的敏感性。随后,我们检测了肝癌细胞和正常肝细胞中VASNmRNA及蛋白水平,结果显示,VASN水平在肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721中较高,在正常肝细胞株HL-7702中较低。Real-timePCR检测VASN在肝癌组织、癌旁组织cDNAarray中的表达水平,结果显示,与正常组织相比,肝癌组织的VASNmRNA水平普遍升高。同样,利用间接免疫荧光实验检测VASN蛋白在肝癌组织切片、良性病变肝组织切片中的表达情况,结果显示,VASN蛋白在肝癌组织中呈高表达,主要表达在癌细胞表面和细胞间隙中;而在肝炎组织中VASN表达水平较低。这些数据均提示VASN可能是肝癌细胞表达并分泌的一个重要分子标志物。
　　第二部分:VASN蛋白作为治疗靶标的初步研究
　　根据我们的工作基础,相关文献报道和生物信息学分析结果,我们推测VASN蛋白可能在肝癌的发生、发展过程中发挥重要作用,因此,我们利用分子生物学技术对VASN的功能进行了探讨。首先,siRNA沉默肝癌细胞中VASN的表达后,MTT实验证实细胞增殖变慢,细胞划痕和Transwell实验均证实细胞迁移变慢,穿膜细胞减少,流式检测发现凋亡细胞增加,免疫印迹实验提示细胞上皮标志蛋白E-cadherin表达增高,间质标志蛋白N-Catenin、Slug表达降低,说明VASN蛋白对肿瘤细胞的增殖、迁移、上皮-间质转化有促进作用,抑制细胞凋亡;单抗抑制实验发现VASN单抗对细胞的增殖也有抑制作用;以上结果提示,作为膜蛋白和/或游离蛋白,VASN可能成为肝癌生物治疗的有效靶标;同时,我们在正常肝细胞株HL-7702中瞬时过表达了VASN蛋白,Real-timePCR、Westernblot检测证实VASN的mRNA、蛋白水平升高,MTT检测提示细胞增殖变快,Transwell实验表明穿膜细胞增多,进一步证实了VASN蛋白的促癌作用。
　　第三部分:肝癌中VASN蛋白水平升高机制的初步探讨
　　生物信息学发现VASN可能是miR-145的靶标。结合我们实验室miR-145的研究基础,即miR-145具有抑癌作用,本论文对miR-145靶向VASN及其生物学作用进行了进一步研究。首先,研究发现在肝癌细胞及正常肝细胞中,VASNmRNA水平与miR-145的水平呈负相关,提示miR-145水平降低可能是导致肝癌中VASN水平升高的原因。通过荧光素酶报告基因,Real-timePCR及Westernblot实验证明了miR-145通过靶向3’UTR(3’Untranslated Regions)区降低VASN的mRNA水平并导致蛋白水平降低。其次,肝癌细胞中过表达miR-145mimics导致细胞形态发生明显改变,细胞失去伪足样突起同时形状变得不规则,细胞迁移能力下降、增殖变慢,与siRNA沉默VASN后细胞变化一致;共转染miR-145抑制剂能逆转上述变化。因此,我们研究结果表明肝癌细胞株中miR-145低表达是导致VASN高水平的一个重要原因,miR-145通过下调VASN水平,从而发挥其抑癌作用。
　　第四部分:hnRNPA1特异适配子BC15在肝癌中的初步应用研究
　　我室利用组织切片-SELEX技术获得了乳腺癌组织特异结合配基BC15,并鉴定出BC15的靶分子为异质性核内核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1,hnRNPA1),进一步的研究证实hnRNPA1蛋白在多种癌症的表达都高于癌旁组织,我们重点研究了该蛋白及其适配子BC15在肝癌诊断与治疗中的作用。结果表明,在临床肝癌组织标本中,包括血清AFP阴性的肝癌组织,BC15检测到的hnRNPA1蛋白的表达阳性率明显高于癌旁正常组织和良性病变组织。提示hnRNPA1蛋白和BC15可能成为肝癌患者尤其是血清AFP阴性的肝癌的辅助诊断标志物和分子探针。在正常肝细胞中过表达hnRNPA1能够促进细胞的增殖和迁移,而在肝癌细胞中沉默hnRNPA1的表达以及转染BC15能够有效抑制细胞的增殖和迁移,提示该蛋白在肝癌的发展过程中发挥重要作用,并且是治疗肝癌的一个潜在药物靶点。BC15比siRNA能更有效抑制细胞增殖,为开发细胞内靶标的适配子类药物打开了更广阔的前景。

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缩略词表

中文摘要

英文摘要

第一部分 肝癌血清标志物的获得与鉴定

前 言

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 实验结果

第二部分 VASN蛋白作为治疗靶标的初步研究

前 言

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三部分 肝癌中VASN蛋白水平升高机制的初步探讨

前 言

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第四部分 hnRNPA1特异适配子BC15在肝癌中的初步应用研究

前 言

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历

发表文章

肝细胞癌标志物的研究进展

1 甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）及AFP异质体（AFP variants）

2 异常凝血酶原（des-γ-carboxy prothrombin，DCP）

3 磷脂酰基醇蛋白聚糖-3（Glypican-3，GPC-3）

4 高尔基体蛋白（Golgi protein 73，GP73）

5γ-谷氨酰转移酶（γ-glutamyl transferase，GGT）

6 转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1）

7 血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)

8 热休克蛋白（Heat shock protein，HSP)

9α-L-岩藻糖苷酶（α-L-fucosidase，AFU）

10 微小RNA（microRNA，miRNA）

结语与展望

参考文献

病理类型特异的卵巢癌组织适配子的鉴定

1材料与方法

2 结果

3 结论

[参考文献]