p52SHC1和p52SHC3对神经元、神经干细胞和PC12细胞周期的影响研究

摘要

成年动物的神经元已经退出细胞周期，不再具有分裂增殖的能力。有报道认为同源分子SHCI和SHC3在神经系统中的分布截然相反，前者仅存在于神经干细胞和前体细胞，后者仅存在于分裂后的神经元。此发现为研究神经元脱离细胞周期的分子机理提供契机。因此我们希望通过研究SHCI和SHC3对可分裂细胞(如NSC)和不可分裂细胞（如神经元）细胞周期的影响，解释神经元为何脱离细胞周期。在此目的下，本文主要探讨分别干涉SHC3和SHC1或者分别表达SHC1和SHC3对神经元和神经干细胞周期的影响，研究过表达SHC1和SHC3及其结构域对PC12细胞周期的影响，揭示SHC3的CH1+SH2结构域促进PC12细胞增殖的分子机理。
　　 本文的研究主要分为以下3部分：
　　 第一部分：SHC1和SHC3对神经元和神经干细胞周期的影响研究。在研究SHC1和SHC3对神经元细胞周期的影响时，我们首先从胎鼠中分离并纯化了皮层神经元，进一步的SHC3染色显示神经元的纯度在99％以上，然后用慢病毒介导的RNAi沉默神经元中SHC3 mRNA，用腺病毒在神经元中表达SHC1。SHC3mRNA干涉后，部分神经元进入细胞周期并伴随着Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A、CDK2和磷酸化CDK2(p-CDK2)表达高调；表达SHC1后，神经元细胞周期没有发生变化，但是Cyclin A、CDK2和p-CDK2的表达出现高调。在研究SHC1和SHC3对神经干细胞(NSC)周期的影响时，我们首先从胎鼠皮层中分离并鉴定了大鼠NSC，然后用慢病毒介导的RNAi沉默神经干细胞中的SHC1，用腺病毒在神经干细胞中表达SHC3。SHC1 mRNA干涉后，神经干细胞周期被抑制伴随着Cyclin E和CyclinA表达下调；表达SHC3后，神经干细胞发生细胞周期阻滞并伴随着Cyclin D1、Cyclin E和Cyclin A表达下调。
　　 第二部分：SHC1、SHC3及其结构域对PC12细胞周期的影响。我们成功克隆了小鼠p52SHC1和p52SHC3的ORF，构建了SHC1、SHC1-PTB、SHC1-PTB+CH1、 SHC1-SH2、 SHC1-CH1+SH2、 SHC3、 SHC3-PTB、SHC3-PTB+CH1、SHC3-SH2、SHC3-CH1+SH2的真核表达载体，利用上述真核表达载体转染PC12细胞，使用流式细胞术和Western Blot分别检测了过表达以上蛋白对PC12细胞周期和细胞周期蛋白的影响。通过流式细胞术的检测，我们发现在转染后36h和60h的PC12细胞中，CH1结构域的存在会影响PTB结构域和SH2结构域的功能，因此在比较PTB和SH2结构域的功能时，必须考虑CH1结构域的存在。流式细胞术和Western Blot检测的结果表明：SHC1提高了CDK2的表达，促使G0/G1期细胞数目减少，SHC3则降低了Cyclin D1和CyclinA的表达，使细胞滞留在G0/G1期；SHC1的PTB结构域能促进Cyclin D1的表达，降低Cyclin A的表达，但是对G0/G1期细胞数目影响不明显，而SHC3的PTB结构域则能降低Cyclin A、Cyclin D1和Cyclin E的表达，使得G0/G1期的细胞比例上升：SHC1和SHC3的SH2结构域均能上调Cyclin D1和Cyclin E的表达，降低G0/G1期细胞的数量，但是SHC3的SH2结构域还能提高CDK2的表达，因此其造成的细胞学效应要比前者大。比较不同结构域引起的细胞学效应，对不同分子来说，SHC3的PTB结构域和SH2结构域要大于SHC1的相应结构域；在同一分子中，对SHC1来说，SH2结构域和PTB结构域的作用差别不明显，对SHC3而言，PTB结构域的功能大于SH2结构域。
　　 第三部分：SHC3的SH2结构域影响PC12细胞周期的分子机理。首先我们使用计算生物学的方法预测了CH1结构域以不同方式结合对其与GRB2结合力的影响，结果发现CH1结构域以正向（从N．末端到C-末端）方式结合的结合能要小于其以反向（从C-末端到N-末端）方式结合的结合能，而GRB2参与的信号通路与细胞增殖正相关，这就导致结合力越大促进细胞增值的能力越强。然后我们使用PCR扩增了SHC3的SH2结构域和CH1结构域，人为将两者的位置颠倒，即由原来的CHI+SH2（反向）变为SH2+CH1（正向），构建了pEGFP-SH2+CH1真核表达载体。最后将pEGFP-CH1+SH2和pEGFP-SH2+CH1转染PC12细胞，使用Co-IP检测CHI+SH2以及SH2+CH1与内源性GRB2的结合力差别，流式细胞术和WesternBlot分别检测细胞周期和细胞周期相关蛋白的变化。Co-IP检测显示，CH1+SH2与GRB2的结合力要远大于SH2+CH1的结合力。流式细胞术和Western Blot检测证明CH1+SH2提高了Cyelin D1、Cyclin E和CDK2的表达，促使G0/G1期细胞数目减少，说明CH1+SH2能促进PC12细胞进入细胞周期，而SH2+ CH1则降低了CyclinA、Cyclin D1和Cyelin E的表达，使G0/G1期细胞数目增加，说明SH2+ CH1抑制了PC12细胞的增殖。
　　 对比研究SHC1和SHC3对神经元和神经干细胞周期的影响，我们发现SHC3在维持神经元的静息状态中起着极其重要的作用，它有可能为众多的中枢神经系统退行性变疾患的治疗提供可能的作用靶点。过表达SHC1、SHC3及其结构域对PC12细胞周期影响的研究初步解释了在脱离细胞周期中SHC3的PTB结构域对它的功能起着主要作用。对SHC3的SH2结构域影响PC12细胞周期分子机理的研究证明SHC3的CH1结构域在向下游传递信号时具有方向性，提示我们CH1结构域以不同方式结合下游分子时会产生不同的细胞学效应.