鼠疫耶尔森氏菌噬菌体Yep-phi基因组研究及其受体鉴定

摘要

鼠疫的病原是鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis,简称鼠疫菌),属于肠杆菌科耶尔森氏菌属。鼠疫在历史上曾经引发三次世界范围的鼠疫大流行,给人类带来巨大的灾难。2000年,世界卫生组织已经将鼠疫列为重新抬头的传染病。鼠疫菌是传统的生物战剂,同时还是国际恐怖分子可能用于制造生物恐怖的首选微生物之一。鼠疫对于人类健康仍然是一个巨大的威胁,尤其是败血症鼠疫和肺鼠疫,若未及时治疗,通常是致命的。抗生素治疗(例如四环素和链霉素)被WHO专家委员会认为是治疗鼠疫的“金标准”,然而,耐药性鼠疫菌的出现给我们敲响了警钟,需要研制能够替代抗生素的方案。1995年在腺鼠疫患者体内分离到了第一株多重耐药鼠疫菌株,该菌株携带了能够抵抗12种抗生素(包括所有用于鼠疫预防和治疗的抗生素)的耐药基因。鼠疫菌噬菌体(bacteriophage)因对宿主的高度特异性和敏感性,对临床诊断和流行病学调查具有重要意义。随着多重耐药(multidrug resistant)鼠疫菌株的出现,噬菌体有可能成为预防和治疗鼠疫菌感染的抗生素替代品。
　　Yep-phi是在中国分离的,常规用于鼠疫菌诊断的噬菌体,在不同温度下均能特异裂解鼠疫菌,在分类地位上属于T7噬菌体家族。Yep-phi的壳体由二十面体对称的头部和尾部组成,头部和尾部通过颈部相连。本研究对Yep-phi进行了全基因组序列的测定(序列登录号:HQ333270)和蛋白质组鉴定,Yep-phi基因组长度为38,611bp,含有217bp的末端重复,GC含量47.12mol％,与宿主鼠疫菌(47.6mol%)相似。共编码45个ORF。并与已测序的同属T7家族的鼠疫菌噬菌体PhiA1122(序列登录号:AY247822)、Berlin(序列登录号:AM183667)和Yepe2(序列登录号:EU734170)进行了比较基因组学分析。结果提示这4株烈性噬菌体可以明显分为两个亚群:Yep-phi亚群(Yep-phi、Berlin和Yepe2)和PhiA1122亚群(PhiA1122)。同源重组是近缘噬菌体的在进化过程中的重要机制,在Yep-phi亚群中预测到四个重组事件,说明这三株噬菌体在进化上是密切相关的。
　　噬菌体裂解细菌的特异性主要取决于噬菌体与细菌细胞壁上特异性受体的相互识别与吸附。了解噬菌体受体结合蛋白与受体的结构功能有助于理解受体识别机制,进一步理解引发感染的后续步骤。目前已经鉴定出八株鼠疫菌噬菌体的受体(L-413C、P2vir1、PhiJA1、PhiA1122、Pokrovskaya、T7Yp、Y和PST),分别位于LPS的不同位置,这八株噬菌体包含了已经测序的PhiA1122和L-413C噬菌体。Yep-phi是T7类噬菌体,已鉴定的T7类噬菌体(例如T7、T3、PhiA1122、PhiYeO3-12)也都是以LPS为受体的。
　　本研究以噬菌体Yep-phi为对象,鉴定了噬菌体受体结合蛋白与受体,通过噬菌体吸附实验、噬菌斑实验、亲和层析和Western Blotting实验,证实了除了鼠疫菌的LPS之外,外膜蛋白OmpF和Ail也是噬菌体受体,并评价了鼠疫菌受体突变株与回补株的裂解效率,鉴定了相互作用的结构域和介导相互作用的关键氨基酸。尾丝蛋白gp17第510-529位氨基酸是介导相互作用的结构域,尾丝蛋白518N、519N、523S是识别OmpF的关键位点,而518N、519N、522C和523S是识别Ail的关键位点。本研究首次鉴定了外膜蛋白可作为T7类噬菌体的受体。而Yep-phi受体与其它T7类噬菌体的差别是由尾丝蛋白的序列特异性所决定的,这项工作证实了尾丝蛋白在进化中和多样的噬菌体系统中的重要性,同时对于发展噬菌体治疗鼠疫菌感染和鉴定鼠疫菌的技术以及理解噬菌体与细菌的相互作用具有重要意义。

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缩略语

前言

1. 噬菌体

2. 鼠疫耶尔森氏菌

3. 鼠疫菌噬菌体

4. 鼠疫菌噬菌体受体研究

5. 本研究的目的与主要内容

第一章 鼠疫菌噬菌体Yep-phi全基因组测序

1. 前言

2. 材料与方法

3. 结果与讨论

4. 小结

第二章 鼠疫菌噬菌体Yep-phi受体鉴定

1. 前言

2. 材料与方法

3. 结果与讨论

4. 小结

参考文献

综述

代表性论文

附录

攻读博士学位期间发表的综述和研究论文

个人简历

致谢