异源反应性NK细胞受体与宿主MHCⅠ类分子匹配程度对aGVHD的影响研究

摘要

骨髓移植(bone marrow transplantation,BMT)是治疗血液系统良恶性疾病和某些实体瘤的有效手段,但移植后的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD),尤其是急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD),在很大程度上限制了其在临床上的广泛开展。国内外学者都在积极探寻降低aGVHD的方法。有研究发现:在异基因造血干细胞移植中,供者来源的同种异体反应性自然杀伤细胞(allo-reactive natural killer cells,allo-NK细胞)可以清除受者体内的白血病细胞,同时降低aGVHD的发生率和严重程度。由于NK细胞发挥生物学效应依赖于其受体与特异性配体的识别与匹配程度,因此推测allo-NK细胞对aGVHD的抑制作用可能与其受体与配体MHCⅠ类分子的匹配程度有关。本研究初步探讨了allo-NK细胞受体与宿主MHCI类分子的匹配程度对其抑制aGVHD的作用和机制,为进一步开展无关供者或半相合NK细胞(如无偿献血者的NK细胞)治疗aGVHD的研究奠定了基础。
　　研究中首先观察了外源性骨髓细胞在主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)全相合、半相合和全不相合受者小鼠内的分布和迁移规律,基于此,建立了供/受者不同MHC分子相合程度的aGVHD小鼠模型。实验思路简述如下:首先,分离萤火虫荧光素酶转基因小鼠C57BL/6J的骨髓细胞,通过尾静脉输注给经过γ射线辐照的C57BL/6J(全相合)、CB6F1(半相合)和BALB/c(全不相合)小鼠,在不同时间点,通过活体成像技术观察荧光素酶标记的骨髓细胞在受者体内的分布规律。结果表明:外源性骨髓细胞在三类受者体内的时空分布规律均呈下列特点:外源性骨髓细胞首先迁移到肺脏,然后依次向肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结迁移,最终定居于骨髓后重建造血,但在细胞分布与迁移的数量和速度上表现出明显的不同。输后1h外源性骨髓细胞主要分布在肺脏,BALB/c小鼠肺脏中的骨髓细胞多于CB6F1和C57BL/6J小鼠;输后4h,肝脏和脾脏中开始出现外源性骨髓细胞并逐渐增多,BALB/c小鼠脾脏中的骨髓细胞增长最快;输后24h,外源性骨髓细胞主要集中在肠系膜,BALB/c小鼠肠系膜中的外源性细胞数量要多于CB6F1小鼠,后者又多于C57BL/6J小鼠。以上结果说明,供者细胞与受者MHC分子不相合程度影响着骨髓细胞迁移到肺脏、肝脏、脾脏和肠系膜淋巴系统的时间、速度,并决定着在这些脏器中驻留的数量和时程。
　　为了研究allo-NK细胞与受者MHC分子匹配程度对aGVHD的影响,首先要建立合适的不同MHC相合程度的aGVHD动物模型。传统移植理论认为预处理的γ射线强度是影响BMT后植入和aGVHD的主要因素,本研究中分别设立8Gy、6Gy和4Gy辐照剂量组,观察、评价单纯辐照和辐照后骨髓移植小鼠的生存期、造血恢复情况和嵌合状态。实验中将辐照的CB6F1和BALB/c小鼠作为受者,单纯辐照组小鼠只辐照不移植骨髓细胞,移植组小鼠辐照后输入C57BL/6J小鼠的骨髓细胞。结果发现:8Gy单纯辐照组和移植组小鼠外周血中白细胞和血小板在+1d开始显著下降,+7d时降低到最低值后缓慢回升,小鼠均在+15~+21d内死亡,濒死时嵌合率大于90％;6Gy移植组小鼠在+7d时,白细胞和血小板降低到最低值,随后逐渐恢复,+2w时嵌合率为50%~75%,存活期超过3个月;4Gy单纯辐照组和移植组小鼠外周血中白细胞和血小板下降幅度小于8Gy和6Gy组,在+7d开始逐渐恢复,+2W时移植组的嵌合率仅21%~41%。综合分析生存期、造血功能恢复和嵌合率的结果,选择6Gy作为建立aGVHD模型的预处理剂量,该模型小鼠活动度较好,方便留取检测样本,同时又可形成一定程度的嵌合状态。
　　为了观察allo-NK细胞受体与受者MHCⅠ类分子的匹配程度对aGVHD的影响和机制,我们将经6Gy辐照后的CB6F1和BALB/c小鼠作为受者,C57BL/6J小鼠作为供者,输入骨髓细胞和脾脏单个核细胞的小鼠作为aGVHD组(对照组),输入骨髓细胞、脾脏单个核细胞和allo-NK细胞的小鼠作为aGVHD+NK组(治疗组),其中CB6F1小鼠的MHCⅠ类分子与输入的NK细胞受体为50%错配,BALB/c小鼠与输入的NK细胞受体为100%错配。结果发现allo-NK细胞可以促进嵌合状态的形成和造血功能的恢复,同时降低aGVHD的发生率并减轻其严重程度,且该效应和供者NK细胞受体与受者MHCI类分子的匹配程度相关。CB6F1小鼠治疗组与对照组相比,输入allo-NK细胞虽然可以加快白细胞的造血重建,但差异没有统计学意义;而BALB/c小鼠,输入allo-NK细胞后,白细胞造血重建明显加快,同时显著改善了aGVHD的临床表现和病理评分,特别是改善了肝脏的病理改变。进一步的研究表明:与未输入NK细胞相比,输入allo-NK细胞的受者外周血中IFN-γ和IL-17A水平下降、IL-10水平升高,脾脏中的Th1/Th2细胞比值降低、Treg/Th17细胞比值升高。
　　通过以上研究可以得出以下结论:
　　(1)外源性骨髓细胞在不同MHC分子匹配程度受者的肺脏、脾脏和肠道中的分布和迁移规律不同,这可能与不同MHC分子匹配程度的骨髓移植后aGVHD的发生率和严重程度不同有关。
　　(2)allo-NK细胞可以促进骨髓移植小鼠的造血功能恢复,改善aGVHD的临床症状和病理评分,且该作用与allo-NK细胞受体与受者的MHCI类分子的匹配程度有关,不匹配程度越高,则该效应越强。
　　(3)allo-NK细胞可通过降低外周血中IFN-γ和IL-17A的水平、升高IL-10的水平来发挥抑制aGVHD的作用。
　　(4)allo-NK细胞可通过降低脾脏中Th1/Th2细胞比值、提高Treg/Th17细胞比值来发挥抑制aGVHD的作用。

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英文摘要

前 言

参考文献

第一部分不同MHC匹配程度骨髓移植模型的建立

引言

材料及方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分骨髓细胞在不同MHC基因型受者中的分布与迁移规律

引言

材料与方法

结果

小结

参考文献

第三部分NK受体与MHC匹配程度对aGVHD作用的影响研究

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第四部分异源反应性NK细胞抑制aGVHD的机制研究

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文总结

文献综述

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