肌肉萎缩相关蛋白MEF2C的结晶和功能研究

摘要

失重引起的肌肉萎缩是危害航天员身体健康的重要元凶之一，对其预防和治疗进行深入研究，对中国载人航天事业的发展具有特别十分重要的意义。MEF2C（Myocyte enhancer factor2C）在众多类型的细胞和组织中表达，包括骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经元、软骨细胞、神经嵴细胞、内皮细胞、脾脏、脑、肝脏等。敲除MEF2C蛋白的小鼠，肌纤维在出生后会迅速出现病变，进而造成心肌、骨骼肌和平滑肌发育的紊乱。经历太空失重飞行的大鼠，MEF2C是其肌肉萎缩组织中下调最显著的蛋白之一，说明MEF2C与肌肉萎缩的发生直接相关。因此，研究MEF2C的结构与功能，能够揭示MEF2C蛋白相关疾病的分子机制，并为相关疾病的治疗提供理论依据和参考。
　　基于此，本论文展开了一系列的研究工作：
　　（1）构建了MEF2C的基因的原核MEF2C-pET30a(+)和真核表达系统MEF2C-pcDNA3.1(+)；
　　（2）MEF2C的表达、纯化和结晶。得到了蛋白高效的表达纯化条件（得到高效的诱导条件为：温度为37℃，1mM IPTG，时间为6h），通过镍亲和层析和凝胶过滤层析得到纯度在90%以上的蛋白，筛选得到了分辨率为8?的MEF2C及DNA片段的复合物蛋白晶体；
　　（3）构建了MEF2C不同表达水平的小鼠成肌细胞C2C12。检测MEF2C表达对细胞形态的影响，5天时过表达组细胞铺展面积增加79%，siRNA组减少6%，说明MEF2C蛋白的表达能够促进细胞扩展；
　　（4）检测MEF2C表达对细胞增殖和周期的影响。5天时过表达组细胞增殖增加33%和siRNA组细胞增殖减少67%；过表达组细胞周期S期增加26%，siRNA组减少11%，说明MEF2C的表达与细胞增殖是正相关的；
　　（5）检测MEF2C表达对细胞分化的影响。发现在分化早期通过影响MyoG的表达，分化中期会影响MyHC的表达，最终通过影响肌分化因子Atrogin的表达来实现；
　　（6）检测MEF2C表达对其直接作用蛋白的影响。得到表达变化最显著的MEF2C的直接作用蛋白分别为MyoD、HDAC4、Notch2、TEF1、和ERK5；
　　（7）检测模拟失重条件对MEF2C及其直接作用蛋白表达的影响。使用随机三维回转技术和小鼠尾悬吊技术模拟失重条件，发现其中表达变化显著的蛋白分别为MEF2C、MyoD、HDAC4。

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