我国部分地区不同来源副溶血弧菌的分子分型及遗传变异研究

摘要

副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus,Vp)为一种嗜盐性的革兰氏阴性菌,是引起食源性疾病的重要病原之一。每年由Vp引起的食物中毒事件在世界各地均有报道,特别是在亚洲。我国卫生部疫情直报系统(http://www.moh.gov.cn/publicfiles//business/htmlfiles/mohwsyjbgs/index.htm)监测显示,在2009～2011年期间Vp是引起细菌性食物中毒事件的首要病因。已知副溶血弧菌有12种O抗原及76种K抗原,自1996年,世界各地出现了一种O3:K6大流行克隆株,该型别菌株具有较强的传播能力和致病性。除了O3:K6外,O4:K8、O4:K68、O1:K25、O3:K29和O1:K56等也是临床常见血清型。相对临床菌株,环境和食品中分离的副溶血弧菌的血清型组合复杂多变。而在我国不同地区、不同来源菌株的血清型分布、毒力特点、基因型别特征和遗传进化关系,以及临床与环境分离株的区别与联系,我们并不完全了解。
　　为了明确上述问题,本研究基于军队传染病病原监测平台,自2010～2011年期间共收集上海、沈阳和北京地区不同来源的副溶血弧菌206株,通过生化鉴定、血清分型和分子生物学技术,分析我国三个不同地区、不同来源Vp菌株的血清型分布及毒力基因携带情况;利用脉冲场凝胶电泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)、多位点序列分型(Multilocussequencetyping,MLST)和多位点可变数目串联重复序列分析(Multilocusvariablenumbertandemrepeatanalysis,MLVA)等分子分型方法,对上述Vp菌株进行分子分型研究,分析不同地区、不同来源、不同血清型Vp菌株的基因型差异与亲缘关系及其变异进化规律,特别是分析了新血清型Vp菌株的基因型特征,探讨临床感染分离株与环境或食品来源分离株的遗传相关性,为弧菌引起的食源性传染病的网络化监测、预警、暴发溯源提供技术支持,为建立全军食品污染物监测网和全军食源性疾病监测网奠定基础。
　　本研究对象来自于三个地区分离鉴定的Vp菌株206株,包括临床病人分离155株,环境或食品分离菌51株。其中沈阳地区51株,均为临床病人分离;北京地区15株临床菌株8株,食品分离株7株;上海地区140株,食品中检测到44株,临床株96株。并监测到3起食物中毒事件,从中分离菌株32株。
　　血清分型显示,对206株菌共分出42种血清型,其中14种血清型组合为国内外首次报道。优势型别为O3:K6,占45.6％,3起食物中毒暴发亦由此型别引起。155株临床菌株,共分为25种血清型。除了O3:K6外,还检测到O4:K8、O4:K68、O1:K25和O3:K29等国内外临床上经常报道的几种血清组合型,以及在临床上很少报道的O3:K25、O1:K56等14种血清组合型。此外,本研究还首次发现了O3:K8、O3:K9、O2:K53、O3:K13、O5:K6、O2:KUT和O4:KUT这7种引起临床感染的血清组合型。而环境菌株中血清型复杂多变,51株菌分为25种血清型,包含O7:KUT、O3:K8、O10:K6、O2:K8、O1:K6、O3:K13、O10:K22、O2:K24、O4:KUT和O4:K18等10种国内外首次报道的血清型。值得关注的是,O1:KUT、O3:K6、O3:K7、O3:K8、O3:K13、O3:KUT、O4:KUT和O10:KUT为环境和临床分离株共有的血清型,提示临床感染与环境污染具有相关性。
　　对206株Vp菌株的tdh(thermostabledirecthemolysin)、tl(thermolabilehemolysin)、trh(thermostabledirecthemolysin-relatedhemolysin)、toxR和flaE等5种毒力基因进行筛检,结果显示,所有菌株均含有tl基因;除了沈阳地区一株菌不含toxR和flaE基因外,其余菌株均携带toxR和flaE基因;trh基因只有2株菌为阳性;70.9%(146株菌)的菌株含tdh基因。在155株临床分离株中,145株tdh基因阳性,阳性率为93.5%;而环境株只有一株阳性。本研究发现国内临床株O3:K6均为toxR+tdh+tl+trh-的大流行菌株,占所有临床菌株的76.1%。此外,值得关注的是,环境和临床分离株共有的血清型中,O3:K6均含有tdh基因,而O10:KUT均不含tdh基因,其余血清型如O1:KUT、O3:K7、O3:K8、O3:K13、O3:KUT和O4:KUT其临床株含tdh基因,环境株却为阴性。以上分析说明,tdh基因是鉴别有毒株与无毒株的标志因子,而本研究中极少数临床菌株tdh基因阴性,这可能与其在传代过程中丢失了tdh基因有关,具体原因还有待深入探究。
　　采用国际肠道病原菌分子分型监测网络PulseNet推荐的PFGE标准方法,对191株副溶血弧菌基因型进行分析。PFGE图谱型导入BioNumerics(Version6.0)数据库软件中进行聚类分析。相似度系数采用Dice系数,聚类方法为UPGMA,位置差异容许度设置为1.5%。191株副溶血弧菌共生成111个PFGE图谱型,按62%cutoff值将其分成十大聚类(一至十),其中聚类三为主要聚类。该聚类又可分成A和B两个亚聚类。亚类A包含104株菌,占所有菌株的54.5%,主要为临床菌株,只存在2株环境菌株。该亚类中,O3抗原血清型菌株占94%,包括所有的O3:K6和O4:K68血清型菌株及O1:KUT和O3:K25菌株,说明O4:K68、O1:KUT和O3:K25与O3:K6具有较近的亲缘关系,可能由O3:K6进化而来。该亚类中,来自上海和沈阳的O3:K6菌株具有明显的地区分布,但也有极个别来自这两个地区的O3:K6菌株具有相同的图谱型,这说明O3:K6菌株可能存在跨地区传播,在传播过程中为了适应当地环境而发生了变异。聚类五共有40株菌,以环境分离株为主(占72.5%),其图谱型差异较大。但是,在该聚类中,1株临床分离的新血清型O5:K6菌株与环境分离的2株O5:KUT和1株O5:K17菌株具有相同图谱型,这说明这3种血清型可能具有较近的亲缘关系。
　　应用PubMLST网络数据库(http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/)提供的标准方案对201株Vp菌株进行MLST分析,共分为63个STs,其中鉴定出90个新的等位基因值和48个新的序列型(Sequencetypes,STs),新STs占76.2%,这说明Vp菌株具有一定的遗传多态性,同时也说明了Vp菌株的易变异性。O3:K6、O3:KUT、O4:K68、O3:K25、O1:K6和O1:KUT等6个血清型共计111株菌均属于ST3,这说明了O4:K68、O3:K25和O3:KUT等血清型可能由O3:K6通过其O抗原和K抗原的突变而遗传进化而来。本研究还发现了14株O4:K8和1株O3:K8菌PFGE图谱型相同,且同属于新序列型ST478,其recA位点基因大小比预期值大,很可能与其它弧菌发生了遗传重组,同时也说明O3:K8可能由O4:K8遗传进化而来。eBURST进化分析显示,ST3为所有STs的Founder,其包含12个SLVs和5个DLVs(Doublelocusvariant),这些STs组成一个大的克隆群(ClonalComplex,CC)。48个新序列型中,ST331、332、333、433、434、435、444、447、448、452、472和478等12个STs具有SLVs或DLVs,其它STs均为Singletons,即与ST3遗传距离较远。
　　此外,本研究从14个VNTR位点中筛选了8个多态性较好的位点,对204株菌进行了MLVA分析。204株Vp菌株被分为156个型别,其中92株O3:K6血清型菌株,被分为59个型别,这说明Vp菌株具有遗传多态性,也证明了本研究建立的MLVA技术的分辨率明显高于PFGE和MLST。聚类分析结果显示,相同血清型菌株一般具有相同VNTR型别或聚在一起,也有一些菌株具有相同的血清型,其MLVA型别却差异较大,即可能具有不同的流行克隆或具有不同进化起源。O4:K68、O3:K25、O3:KUT、O1:KUT和O1:K33等血清型菌株与O3:K6血清型菌株聚类一起,说明这些型别可能由O3:K6遗传进化而来。对于O3:K6和O4:K8这两种临床常见血清型而言,其VNTR型别具有明显的地区差异。以上分析为将来Vp引起的感染或食物中毒暴发的溯源调查提供了依据。MST(Minimumspanningtree)进化分析显示,O3:K6为其它血清型菌株的祖先,即其它血清型菌株可能由O3:K6遗传进化而来。
　　通过以上分析,本研究获得了以下有意义的研究结果:①初步分析了我国不同地区、不同来源Vp菌株的血清型别特征,并在国内外首次发现了14种新的血清组合,其中包含7种可引起临床感染的血清型;②分析了环境与临床不同来源Vp菌株的毒力基因携带情况,认为tdh基因可作为区别有毒株与无毒株的标识;③采用PFGE、MLST和MLVA等3种分子分型方法对收集的Vp菌株进行了分析,检测到90个新的等位基因值和48个新STs,发现了recA管家基因的重组现象,这反映了Vp菌株的易变异性;④通过分子分型分析,发现Vp具有遗传多态性,且环境分离株的多态性高于临床分离株。遗传进化分析显示,O4:K68、O3:K25、O3:KUT和O1:KUT等血清型可能由O3:K6遗传进化而来;⑤为Vp临床感染与环境或食品污染的相关性提供了一定数据支持;
　　本研究所建立的分型方法和所获得的核酸指纹基础数据,为食源性传染病病原的鉴定溯源、新型病原的发现、食物中毒事件的确认及流行病学调查、病原体遗传变异以及种群进化分析提供了技术支持,并为军队传染病病原分子分型监测网络的建立奠定基础,为食品污染监测提供有益的指标。

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英 文 缩 略 词 表

中文摘要

英文摘要

前 言

2、副溶血弧菌的生物学特征

3、Vp菌株的分子分型

4、本研究的目的意义

第一部分 副溶血弧菌的鉴定及其毒力基因分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 副溶血弧菌的PFGE分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 副溶血弧菌的MLST分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分 副溶血弧菌的MLVA分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

结 论

附 表

附表1：沈阳地区部分菌株基本信息数据表

附表2：上海地区部分菌株基本信息数据表

参考文献

综述

论 著

个 人 简 历

致谢