炭疽毒素致死因子的重组制备与检测方法研究

摘要

炭疽是一类严重威胁人类健康的烈性传染病,其病原体为炭疽芽孢杆菌(简称炭疽杆菌)。炭疽杆菌在不适宜的生存条件下会形成具有极强抗逆性的芽孢,其芽孢由于具有存活时间长、易于制备、易于散布等特性,是非常理想的生物战剂和生物恐怖的原材料。
　　炭疽杆菌的毒力因子有两大类,一是荚膜,一是外毒素。荚膜的功能是抵抗宿主的吞噬作用,帮助炭疽杆菌在宿主体内感染和生存。而炭疽杆菌的外毒素则被认为是其致死的最主要因素,包含三种成分,水肿因子(edema factor,EF),致死因子(lethal factor,LF),保护性抗原(protective antigen,PA)。其中PA可以与其细胞表面受体结合,被furin样蛋白酶切割并组装成七聚体或八聚体;EF和LF可以与PA多聚体结合,形成的复合物通过内吞作用进入细胞。在胞质内,EF具有腺苷酸环化酶的活性,能够上调cAMP的水平,LF具有金属蛋白酶的活性,能够切割MEK蛋白家族的成员。学界目前对炭疽感染者损伤甚至死亡的具体机制还不清楚,但认为两类炭疽毒素,致死毒素LT(lethal toxin,即PA与LF的混合物)和水肿毒素ET(edema toxin,即PA与EF的混合物)在其中发挥着主要作用,这也是炭疽感染晚期单纯的抗生素治疗难以发挥疗效的原因。
　　因此,在炭疽感染中,准确检测毒素水平显得非常必要:在感染早期,对毒素的检测可以作为诊断手段;在治疗中,实时监测毒素水平的变化对于评价治疗效果和患者的安全状况也有重要的意义。
　　LF作为炭疽杆菌外毒素的重要组成部分,是炭疽感染中造成损伤和致死的主要成分之一,因此本研究的主要目标之一就是期望建立方便灵敏实用的针对LF的检测方法。为了给检测方法研究准备材料,同时也为了给本室及其他同行关于LF作用机理的研究提供支持,本研究将建立简单高效的LF制备方法作为本研究的另一重要目标。
　　目前在LF的制备工作中存在的主要问题包括生物安全风险,氨基酸序列尤其是N端序列有异于天然蛋白,纯化工艺复杂、效率不高等。
　　本研究立足于大肠杆菌表达系统,从而降低了生物安全的风险。但在实际工作中发现,目的蛋白在大肠杆菌表达系统中的表达水平又成为了限制条件。
　　因此,本研究从核酸水平上对LF表达的限制因素进行了分析。通过构建一系列的截短突变体进行表达分析,并借助网络工具JCat进行序列分析,发现LFC端的编码序列存在两个稀有密码子密集的区域,推测这两段序列限制了LF在大肠杆菌表达系统中的表达水平。通过对这两个区域的密码子进行优化,实现了LF表达量的提高。
　　在此基础上,对周质蛋白的抽提方式和LF的纯化方法进行了优化。经过优化的渗透休克法处理和CHTTM陶瓷羟基磷灰石层析柱与Source 30Q阴离子层析柱两步层析纯化,可以得到纯度大于95％的目的蛋白,产量可达5mg/L。
　　利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹分析、氨基端测序,以及细胞毒性试验和大鼠攻毒试验,对LF进行了性质鉴定。结果表明,该方法可以得到纯度高(大于95%)、序列天然、活性高的LF,可以满足炭疽基础研究、疫苗和防治药物研究等多种需求。
　　在LF制备工艺建立起来的基础上,本研究进一步探索了LF的检测方法。考虑到LF具有较强的细胞毒性,本研究关注了利用LF的细胞毒性对其进行检测的可行性。小鼠巨噬细胞系J774A.1细胞对LF的细胞毒性非常敏感,因此利用该细胞检测LF可能会得到比较理想的灵敏度。本研究首先利用细胞毒性试验测定了LF作用于J774A.1细胞的EC50值,在此基础上,对检测过程中的条件进行优化,建立起了操作简单、灵敏度高的LF检测方法。该方法在Fischer344大鼠模型中得到了验证,并利用该方法,初步计算了LF在Fischer344大鼠血液内的半衰期。该部分工作建立了利用细胞毒性试验检测血液中LF的方法,该方法在灵敏性、经济性和实用性等方面显示了一定的优势,为炭疽的相关研究及临床诊断和治疗中的LF检测提供了新的选择。
　　为了探索更灵敏更稳定的检测方法,本研究又进一步关注了LF的酶活性。LF作为炭疽致死毒素的酶活性组份,在进入细胞后具有Zn2+依赖的金属蛋白酶活性,能够特异地切割MEK蛋白家族的成员。目前,已有多项在研的针对这一性质的LF检测方法,但这些研究往往需要利用质谱、高效液相色谱等复杂的技术和设备。本研究期望在此基础上设计出一套既灵敏又简单的LF检测方法。
　　本研究将MEK中LF的酶切位点部分对应的DNA序列添加到大肠杆菌碱性磷酸酶(AP)野生型或突变体的编码基因的上游,并在融合蛋白的N端添加多聚组氨酸标签(His标签),成功构建了融合蛋白MEKAP的重组表达质粒并进行了表达纯化。将得到的MEKAP用于LF的检测:通过一系列类似于酶联免疫吸附法的操作,实现了对LF的检测。本研究设计的检测方法不需要质谱仪、高效液相色谱等复杂设备,其操作流程简单,可检测到31ng的目的蛋白,显示了较好的应用前景。
　　综上所述,本研究首先建立了简便高效的LF制备工艺,在此基础上,利用LF的细胞毒性和酶活性,对其检测方法进行了探索:利用小鼠巨噬细胞J744A.1对LF细胞毒性的敏感性,建立了基于细胞毒性试验检测LF的方法,并在大鼠动物模型上进行了验证,初步估算了LF在大鼠血液内的半衰期;利用LF切割MEK蛋白家族成员的性质,设计了基于LF的酶活性检测LF的简便方法,并验证了其可行性。这些工作为炭疽的临床诊断治疗和相关的机理研究提供了支持。

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主要缩略词表

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前言

第一部分 炭疽毒素致死因子的重组制备

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第二部分 利用细胞毒性试验检测血液中炭疽毒素致死因子的方法学研究

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第三部分 利用炭疽毒素致死因子的蛋白酶活性进行检测的方法探索

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

总结

参考文献

附录 主要溶液配制

文献综述

代表性论著

个人简历

致谢