氧化葡萄糖酸杆菌筛选及生物转化制备N-烷基-1-脱氧野尻霉素中间体的研究

摘要

本文从自然界采集样品中筛选了氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)，对其培养条件进行了研究；进而研究了利用所选G.oxydans菌微生物转化葡甲胺、N-羟乙基葡萄糖胺制备N-烷基-1-脱氧野尻霉素中间体的转化条件和产物的分离、纯化及结构鉴定。通过从采集样品筛选，得到了一株生长状况良好，转化能力强的G.oxydans菌种。利用微生物转化法，对化学合成的N-羟乙基葡萄糖胺和纯品葡甲胺进行结构改造，分别得到6-(2-羟乙基)氨基-6-脱氧-α-L-呋喃山梨糖和6-甲氨基-6-脱氧-α-L-呋喃山梨糖两种转化产物，它们是制备两种新型抗糖尿病药物N-羟乙基-1-脱氧野尻霉素和N-甲基-1-脱氧野尻霉素的关键中间体。实验结果表明，在以甘露醇为碳源、酵母粉为氮源的摇瓶培养基中，能迅速得到较大量的所属菌体，适宜的摇瓶培养条件为28℃，200rpm，27h。在微生物转化过程中，温度、pH、转化时间、底物和静息细胞浓度均对转化率有较大影响，尤其是后三种因素有很强的相关性。对后三种因素进行正交实验比较表明，当转化系统采用初始pH5.0、底物和静息细胞浓度之比为1：3、30℃转化8h时，转化率可达99％。转化过程中对转化产物的检测采用薄层色谱法(TLC)和羰基显色反应法，可得到清晰的产物显色结果。转化产物的固化分离采用薄层色谱法和溶剂沉淀法，均得到白色固体产物，通过红外光谱法(IR)和核磁共振法(NMR)检测，结果表明：由溶剂沉淀法分离纯化得到葡甲胺转化产物经IR和NMR鉴定，为制备N-甲基-1-脱氧野尻霉素的关键中间体。N-羟乙基-1-脱氧野尻霉素和N-甲基-1-脱氧野尻霉素都具有多种药理学活性，是高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，特别是米格列醇降血糖效果显著，副作用小，是治疗Ⅱ形糖尿病的高效、安全药物。

目录

文摘

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第一章前言

1.1氧化葡萄糖酸杆菌及其酶系研究现状

1.2糖尿病和抗糖尿病药物概述

1.2.1糖尿病与糖尿病并发症

1.2.2临床上常用的治疗Ⅱ型糖尿病的药物

1.3 N-烷基-1-脱氧野尻霉素药理作用与临床应用

1.3.1 N-烷基-1-脱氧野尻霉素的抑制糖类水解和降血糖作用

1.3.2 N-烷基-1-脱氧野尻霉素的抑制糖蛋白成熟作用

1.3.3 N-烷基-1-脱氧野尻霉素的抑制糖原分解作用

1.3.4 N-烷基-1-脱氧野尻霉素在其它方面的应用

1.3.5临床应用及药效

1.4 N-烷基-1-脱氧野尻霉素的制备工艺

1.4.1化学合成法

1.4.2微生物转化与化学合成组合法

1.5微生物转化法简述及其特点

第二章实验材料、内容和分析方法

2.1实验材料与仪器

2.1.1主要药品与试剂

2.1.2仪器设备

2.2实验内容

2.2.1 G. oxydans菌种筛选方法和步骤

2.2.2 G. oxydans菌种的培养与收集

2.2.3微生物转化法制备N-烷基-1-脱氧野尻霉素中间体

2.3实验分析方法

2.3.1薄层色谱法

2.3.2羰基显色反应

2.3.3红外光谱法

2.3.4核磁共振法

第三章菌种筛选和初步鉴定

3.1样品采集

3.2培养基

3.3菌种筛选

3.3.1富集培养

3.3.2菌种筛选过程

3.4菌种的初步鉴定

3.4.1斜面培养菌种同化碳源及好氧检测

3.4.2细胞代谢产酸检测

3.4.3培养菌体的显微镜检测

3.4.4菌体生长周期测定

3.4.5菌体对葡甲胺转化性能的检测

3.5小结

第四章菌体培养条件的研究

4.1斜面保藏/摇瓶培养基的确定

4.1.1斜面保藏培养基的确定

4.1.2摇瓶培养基的确定

4.2菌体生长曲线及氧化酶产生时间测定

4.2.1测定菌体生长曲线方法与结果

4.2.2胞内氧化酶产生时间测定

4.3摇瓶溶氧量的考察

4.4 2L发酵罐扩大培养制备菌体探索

4.5 小结

第五章微生物转化条件的考察

5.1转化原理分析

5.2转化反应辅助因子的考察

5.3转化时间、底物浓度及静息细胞浓度的相关性考察

5.3.1以转化时间、底物浓度及静息细胞浓度为因素作正交实验

5.3.2正交实验结果分析

5.4温度对转化的影响

5.5 pH对转化的影响

5.6细胞重复利用对转化的影响

5.7最大底物浓度的考察

5.8 小结

第六章转化产物的分离与鉴定

6.1转化液中转化产物的检测

6.1.1薄层层析法检测

6.1.2羰基显色反应检测

6.2转化产物的分离与鉴定

6.2.1薄层色谱法分离步骤

6.2.2有机溶剂沉淀法分离步骤

6.2.3 TLC法分离产物鉴定

6.2.4溶剂沉淀法分离产物鉴定

6.3小结

结 论

附录

参考文献

致 谢