CTCF介导不同类型染色质相互作用的研究

摘要

CCCTC序列结合因子，即CTCF，是一种广泛表达的多功能锌指蛋白，其序列高度保守，目前被认为是脊椎动物中唯一的绝缘子调控蛋白。CTCF最早被发现为鸡c-myc基因的转录阻遏物，后续研究不断揭示CTCF参与多种生物学过程，具有不同功能，主要包括:基因转录的抑制与活化、绝缘子调控、印迹基因调控、X染色体失活、影响mRNA可变剪接、影响核小体重排、影响DNA复制与重组等。CTCF表达异常往往与多种疾病、肿瘤的发生发展等密切相关。
　　通过自身11个锌指结构的不同组合，CTCF能够选择性识别数万个靶位点，其靶位点在基因组内广泛分布，并且CTCF与靶位点的结合跟DNA甲基化状态存在动态调控机制，进而形成细胞类型特异性结合位点，同时，不同位点间还存在不同的保守性和序列特征。除了具有众多的结合位点，通过自身蛋白序列N-端和C-端的内在无序结构特点以及多种翻译后修饰等方式，CTCF还可以与众多不同蛋白、甚至RNA直接相互作用。另外，CTCF还被证实能够结合于细胞有丝分裂期染色体，可能作为有丝分裂书签因子发挥作用，但具体分子机制及潜在功能仍有待探索。
　　作为染色质三维高级结构的主要组织者，依靠众多的结合位点以及其它蛋白、甚至RNA的帮助，CTCF能够介导广泛的染色质内、染色质间相互作用，帮助建立和维持染色质高级构象，进而发挥其多种多样的功能。但目前为止，对于CTCF结合染色质上的不同类型结合位点、介导不同类型染色质相互作用、发挥多种多样的不同类型生理功能三者之间的关系还停留在个别现象或有限局部数据分析上，其内在的对应关系、生物学意义及背后的生物学逻辑仍有待全面、系统地深入研究。
　　本文利用包括人类基因组CTCF结合位点在内的来源于ENCODE等的ChIP数据、介导染色质相互作用的ChIA-PET数据，来源于modENCODE等的果蝇基因组dCTCF结合位点及其随有丝分裂周期变化的ChIP数据，以及其它转录因子、组蛋白表观修饰谱等多层次、多维度的组学数据，结合多种基因组信息数据库，通过多种生物信息学分析工具及算法，从“结合位点”、“相互作用”、“有丝分裂周期传递”三方面对CTCF不同类型的全基因组图谱进行了细致而全面的系统生物学分析。
　　第一部分，我们从ENCODE数据库中整理得到人类基因组70个细胞系共162，209个CTCF结合位点，分析提取得到其三段式结合基序(three-part motif)，并且发现结合位点的细胞类型特异性、基序motif显著性、序列保守性三者之间存在一定的相关性，即细胞类型非特异性越高的位点，其motif显著性越强，其保守性越高。我们认为:在大多数细胞中共有的非特异性结合位点，即组成性位点，可能作为基因组内的关键性节点，在进化选择压力下，最终维持高保守性，同时，显著的motif能够提供更高的亲和力，从而与CTCF蛋白更稳定地结合。
　　随后，对于CTCF靶基因的功能学分析结果显示:细胞类型特异性CTCF结合位点可能与细胞类型特异性基因表达调控相关联，非特异性位点靶基因则对应于所有细胞都必需的基本生物学功能。同时，我们从新的角度，对160个能够与CTCF结合位点共定位的转录因子进行聚类分析，首次将其分为四种不同类型，提示CTCF能够在不同类型结合位点募集到不同类型的转录因子，进而发挥不同的生物学功能。
　　第二部分内容着眼于人类基因组内CTCF参与介导的染色质相互作用。我们首先总结出CTCF结合位点的细胞类型非特异性（组成性）是其参与介导染色质相互作用的充要条件，即非特异性的结合位点倾向于参与相互作用，而且参与相互作用的位点也大多是细胞类型高度非特异性的。进一步地，我们从拓扑学的角度，发现细胞类型高度非特异性的CTCF结合位点往往处于染色质相互作用网络的中心位置，在维持网络的连通性、稳定性、鲁棒性等过程中发挥关键性作用，我们认为这类型结合位点可能充当染色质三维结构的底盘或骨架节点。此外，我们首次发现CTCF能够建立一种特殊的“多对多”相互作用结构，该结构可能参与构建和维持小鼠物种特异性染色质区域的三维结构，但是在人类基因组中的作用和意义还有待进一步探索。
　　另一方面，通过整合不同转录因子共定位、组蛋白表观修饰谱、染色体状态等数据，我们将CTCF介导的染色质相互作用分为不同类型，同时发现cohesin复合物和ZNF143分子可能在帮助CTCF建立和维持稳定的染色质相互作用中发挥重要功能，其中cohesin已有前人相关文献报道，而ZNF143的具体功能机制还有待进一步研究。综合以上结果，我们认为CTCF在其介导的染色质相互作用网络中，能够起到底盘式的功能，选择性识别特定靶位点，建立染色质相互作用关系，并在cohesin复合物和ZNF143的帮助下，形成稳定的、不同类型的相互作用，其中一部分作为染色质三维结构的骨架，维持染色质构象的稳定性，另一部分进一步募集其他转录因子，产生不同的基因转录调控机制。
　　第三部分着眼于考察CTCF与染色质的结合在细胞身份(cell identity)的建立与维持中的重要作用。我们以有丝分裂为切入点，以模式生物果蝇为研究对象，分类讨论细胞有丝分裂周期不同阶段，dCTCF在果蝇基因组上结合情况的变化及相应的生物学意义。我们首先将dCTCF位点分为间期—分裂期共有（IM）、间期特有(IO)、分裂期特有(MO)三类。通过motif、 GC含量、保守性等序列特征分析，发现MO位点与IM、IO存在不同序列特征，我们推测是由于染色体在有丝分裂期大量凝缩，形态环境、物理学特性等可能与间期完全不同所致，dCTCF结合于分裂期染色体特有的那部分结合位点即MO位点可能基于一种新的分子机制。同时还发现IM位点具有明显高于其它类型位点的motif强度、ChIP信号强度及保守性，且相关靶基因涉及到多种生物学过程，既跟细胞基本生理活动相关，又与有丝分裂进程密切联系，充分说明dCTCF稳定结合于IM位点对于维持正常的细胞活动，特别是细胞身份的建立与维持等具有重要意义。
　　随后我们进一步发现，相同类型的dCTCF位点呈现相互聚集倾向，并且富集有dCTCF结合位点的TAD结构域边界以及果蝇基因组保守性结构域边界，同样也具有这种“相同类型聚集”（物以类聚）的倾向。我们认为dCTCF在有丝分裂周期不同阶段可能参与建立不同的TAD结构，同时还帮助维持基因组保守性区域的高级构象。
　　基于上述结果，我们推测CTCF在有丝分裂期结合于染色体的可能生物学意义主要有以下几个方面:一方面，CTCF通过与那些需要在有丝分裂期发挥特定功能的靶基因的相应结合位点结合，参与这些特殊基因的转录调控，同时CTCF还可以在有丝分裂M/G1期过渡后快速建立起新的转录调控网络以利于细胞活动;另一方面，CTCF在分裂期可能参与建立分裂期特异性的染色质构象，并在细胞进入间期后帮助染色质迅速重建新的三维结构。
　　综合上述三部分内容，本文通过从横向的有丝分裂间期的点（结合位点）到面（相互作用网络），再到纵向的整个细胞周期动态变化过程的完整研究模式，系统构建基因组内CTCF全方位、多层次图谱，深度解析CTCF的功能及其背后的生物学意义，对CTCF的相关研究提供了重要的实验资源和理论依据。

目录

声明

缩略词表

摘要

第1章 前言

1．1 研究背景

1．1．1 CTCF是一种多功能蛋白

1．1．2 CTCF结合位点在基因组内广泛分布

1．1．3 CTCF能够与多种蛋白、RNA相互作用

1．1．4 CTCF介导全基因组不同类型染色质相互作用

1．1．5 CTCF结合位点在有丝分裂过程中的遗传

1．2 科学问题

1．3 研究意义

1．4 研究方案

第2章 CTCF结合位点在人类基因组中分布及序列特点

2．1 人类基因组CTCF结合位点数据集

2．2 CTCF结合位点基序motif及保守性分析

2．3 CTCF结合位点分布及功能学分析

2．4 CTCF共定位转录因子分析

2．5 讨论与小结

第3章 CTCF介导人类全基因组不同类型染色质相互作用

3．1 CTCF介导广泛的染色质内、间相互作用

3．2 CTCF介导染色质相互作用网络的拓扑学分析

3．3 多种转录因子参与CTCF介导的染色质相互作用

3．4 讨论与小结

第4章 果蝇dCTCF在细胞有丝分裂周期中的潜在功能

4．1 dCTCF结合位点在细胞周期中的动态变化

4．2 dCTCF结合位点的功能学分析

4．3 dCTCF对维持和重建染色质结构域的作用

4．4 讨论与小结

第5章 结论

插图索引

表格索引

参考文献

文献综述 CTCF及其介导染色质相互作用的研究进展

代表性著作

个人简历

致谢