羟基化磁性微粒分离纯化糖结合蛋白方法的建立及应用

摘要

研究背景：糖结合蛋白(glycan binding proteins，GBPs)通过和糖蛋白糖链或糖脂糖链的相互作用调控细胞间的识别、信号传递、细胞的内吞和细胞内物质的运输、细胞生长、分化以及凋亡、外界病原微生物的感染等一些最基本的也是最主要的生物学功能。目前，国内外对GBPs分离提取主要采取亲和层析和离子交换层析相结合的方法，但是由于此方法非特异性吸附强、费时费力、操作复杂、目的蛋白需要浓缩等缺点，不利于低丰度蛋白的研究。基于GBPs分离技术存在的不足，我们发展了基于磁性微粒分离纯化GBPs的新技术，能高效率、快速、简便的对GBPs进行分离纯化。 目的：建立以功能化磁性微粒为载体共价偶联还原糖链的方法，利用联有糖链的功能化磁性微粒对生物学蛋白样品进行糖结合蛋白的分离纯化，并对得到的糖结合蛋白进行蛋白质组学的初步研究。 方法：以功能化磁性微粒为载体共价偶联甘露糖、葡萄糖以及纤维二糖，对三种糖的固定化及分离提取糖结合蛋白的条件进行优化。对健康人血清、大骨节病人血清以及肝癌病人血清中的糖结合蛋白进行分离提取，并对所得到的蛋白进行双向电泳，通过2DImageMaster分析软件对双向电泳凝胶进行背景消减，蛋白点识别及匹配。比较病人与健康人血清中糖结合蛋白表达的差异。 结果：通过还原糖链与四种功能化磁性微粒(Fe3O4磁性微粒、环氧化磁性微粒、肼化磁性微粒以及羟基化磁性微粒)偶联的比较，实验结果表明羟基化磁性微粒对还原糖链偶联的能力以及稳定性强与其他三种磁性微粒。接着又对磁性微粒羟基化修饰的条件进行了优化，确定了最佳化学修饰时间、4—羟基苯甲酰肼浓度以及反应温度。通过对糖链与羟基化磁性微粒最适偶联缓冲体系、偶联缓冲液的pH、偶联温度条件的优化，使糖链与羟基化磁性微粒的偶联量达到最佳。研究了结合缓冲体系及洗脱体系对糖磁粒复合体(联有糖链的磁性微粒)稳定性的影响，结果表明二者对该复合体稳定性并无显著的影响。确定1％ SDS作为糖结合蛋白洗脱缓冲液。利用该方法对健康人血清、大骨节病人血清以及肝癌病人血清进行了糖结合蛋白的分离纯化，通过SDS—PAGE电泳以及银染显色显示出患者与健康人血清中糖结合蛋白的异同，又结合2D电泳技术及其图像分析，分别建立了健康人血清和大骨节病人血清，健康人与肝癌病人血清中糖结合蛋白的差异图谱。 结论：以羟基化磁性微粒为载体可实现各种还原糖的固定化修饰。在相同条件下可对多种还原糖链进行有效偶联。利用羟基化磁性微粒固定还原糖链分离纯化复杂样本中的糖结合蛋白，此方法能降低蛋白质组份的复杂性，可应用于蛋白质组学研究。结合双向电泳技术建立了健康人血清和病人血清糖结合蛋白的差异表达谱。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1本课题的研究目的和意义

2本课题的主要研究内容

3本课题的主要技术路线

第一章绪论

1.1糖生物学的简要概况

1.1.1 糖生物学的产生

1.1.2各国的糖生物学发展概况

1.1.3 糖生物学研究的内容

1.1.4 糖生物学研究的特点

1.1.5 糖组学在各个领域的作用

1.1.6糖生物学研究的发展趋势

1.2糖结合蛋白的概述

1.2.1 动物体内糖结合蛋白的类型

1.2.2 糖结合蛋白与糖链的识别机制

1.2.3 糖结合蛋白的生物学功能

1.3糖结合蛋白分离提取的方法

1.3.1 国内外研究者的方法

1.3.2本实验室的设计方法

第二章羟基化磁性微粒分离纯化糖结合蛋白方法的建立

2.1引言

2.2实验材料和方法

2.2.1主要试剂和仪器

2.2.2 实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1磁性微粒的选择

2.3.2偶联缓冲液体系的选择

2.3.3最适偶联缓冲液pH的选择

2.3.4偶联时间及温度对偶联量的影响

2.3.5 4-羟基苯甲酰肼量对偶联量的影响

2.3.6羟基化修饰时间对偶联量的影响

2.3.7磁性微粒及糖磁粒复合物的红外测定

2.3.8糖磁粒复合物稳定性的测定

2.3.9洗脱缓冲液及其浓度的选择

2.3.10洗脱时间的选择

2.3.11糖磁粒复合物对糖结合蛋白分离纯化的特异性验证

2.3.12糖结合蛋白的回收率

2.4本章小结

第三章分离纯化GBPs技术在大骨节病糖结合蛋白组学中的应用

3.1引言

3.2实验材料和方法

3.2.1主要试剂和仪器

3.2.2实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1 洗脱组分样品的浓度测定结果

3.3.2 SDS-PAGE及银染结果

3.3.3 双向电泳及银染结果

3.4本章小结

第四章 分离纯化GBPs技术在肝癌糖结合蛋白组学中的应用

4.1引言

4.2实验材料和方法

4.2.1主要试剂和仪器

4.2.2实验方法

4.3结果与讨论

4.3.1 洗脱组分样品的浓度测定结果

4.3.2 SDS-PAGE及银染结果

4.3.3 双向电泳及银染结果

4.4本章小结

全文小结

1 论文工作的主要内容和研究成果

1.1羟基化磁性微粒分离纯化糖结合蛋白方法的建立

1.2大骨节、肝癌病人血清中的糖结合蛋白质组学的初步研究

2 进一步工作需要解决的问题

参考文献

附录

攻读硕士期间的研究成果及发表论文

致谢