铜绿假单胞菌铁反应基因调控的研究

摘要

对大多数细菌而言，铁是一个必不可少的营养元素。尽管地球上铁含量丰富，但在大多数环境中铁对生物体而言是难以获得的。铁限制是宿主防御病原菌侵害的第一道防线：另一方面过多的铁又会导致氧化伤害。为了避免铁吸收过程中各种过度放任导致的不良后果，微生物进化了复杂而又巧妙的遗传和生化机制以控制铁的吸收、代谢和平衡。群体感应系统是一个细胞密度依赖的全局性基因表达调节系统，它与铁调节系统相互作用编织出复杂的调控网络。 铜绿假单胞菌是一种重要的机会致病菌，可引起包括囊胞性纤维症病人的慢性肺感染等多种感染性疾病，是主要的医源性感染源。该菌具有庞大的基因组和复杂多样的调节机制，来调控各种毒性因子的表达和生理生化活动以适应环境变化。 本文分别对该基因组中两个铁反应基因，编码双组分反应调节子的PA2572和编码柠檬酸铁吸收途径sigma因子的PA3899进行功能研究。首先分别构建两基因的铜绿假单胞菌PAO1的敲除突变体，并利用无启动子的luxABCDE发光基因作为报告基因进行启动子活性研究。研究发现PA2572对铁载体的合成基因pchDCBA和pvdF以及未知功能基因PA3849的表达有影响；PA3899对pvdF和oprL基因也有一定的作用，预示着两个基因分别与铁载体吸收系统有一定的调控关系。两基因对其他铁反应基因，QS系统及其调节的毒性因子基因没有明显调节作用；而QS系统对PA2572和PA3899分别具有促进和抑制作用。研究还发现铁对QS系统及其毒性因子基因的表达具有一定促进作用；铁对生物被膜的产生是不利的，高铁条件下突变体PAO1(△2572)和PAO1(△3899)的生物被膜产量也较野生型PAO1的少。 tol—oprL基因在维持外膜完整性，转膜运输以及革兰氏阴性菌的细胞分裂方面起着重要的作用。在铜绿假单胞菌中，tol—oprL基因簇由独特的三个操纵子组成：orf1—tolQRA，tolB和oprL—orf2，它们均受到铁的调节。TolQRA复合物和铁运输系统的ExbBD—TonB具有相似性，其功能可以部分互相代替。本文研究了orf1—tolQRA操纵子的启动子及其表达图特性，并对Orf1的功能进行了研究。通过放射标记和荧光标记的引物延伸反应，以及以lacZ和luxABCDE为报告子的启动子活性研究，发现tolQRA上游有两个不同的启动子，一个位于orf1的前面是组成型的，一个位于orf1内部是受铁调控的。在生长稳定期，tol—oprL操纵子均受到QS系统的抑制。与tolQ和tolA突变体不可存活不同，可存活的orf1敲除突变株是可以构建的，该突变体的细胞和克隆形态均有变化。首次证明铜绿假单胞菌中，Orf1在Tol—OprL复合物中起着并非必不可少的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩略语

声明

第一章绪论

1.1铜绿假单胞菌介绍

1.2铜绿假单胞菌对铁的吸收

1.2.1铜绿假单胞菌可利用多种铁源

1.2.2 phu和has途径获取不同来源的血红素

1.2.3 siderophore媒介的铁吸收系统

1.2.4铁的跨膜运输

1.3铜绿假单胞菌铁的调节

1.3.1 Fur蛋白

1.3.2小RNA PrrF

1.3.3 ECF sigma的调节

1.4铜绿假单胞菌群体感应系统及其调节机制

1.5铜绿假单胞菌铁与QS系统的关系

1.5.1铁与QS系统相互联系

1.5.2铁对QS系统的调控

1.5.3 QS系统对铁反应基因的调控

1.5.4 QS系统化合物对铁的螯合作用

1.6生物被膜

1.7含有HD-GYP结构域的双组分反应调节子.

1.8 tol-oprL系统的结构及特点

1.9 tol-oprL系统的功能

1.10铜绿假单胞菌中tol-oprL的特点

1.11 Orfl蛋白

1.12研究内容、目的和意义

第二章实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2培养基的配置

2.1.3试剂

2.1.4仪器

2.2菌体的培养条件

2.3基本实验方法

2.3.1 PCR扩增及纯化

2.3.2质粒的小量提取

2.3.3质粒或DNA片断的酶切和连接

2.3.4感受态细胞的制备

2.3.5铜绿假单胞菌感受态细胞的快速制备方法

2.3.6电转化

2.3.7重组菌株的筛选

2.3.8三亲株杂交实验

2.3.9含有lux报告子融合基因表达的检测

2.3.10含有lacZ报道子融合基因检测

2.3.11生物被膜实验

2.4 PA2572实验的方法

2.4.1 PA2572敲除突变体的构建

2.4.2含有lux的报告子在PAO1(△2572)中的表达测定

2.4.3 pMS402-2572在QS系统突变株中表达的测定

2.4.4泳动实验

2.5有关PA3899实验方法

2.5.1 PAO(△3899)突变体的构建

2.5.2含有lux的报告子在PAO1(△3899)中的表达测定

2.5.3 pMS402-3899在QS系统突变体中表达的测定

2.6 tol-oprL的实验方法

2.6.1总RNA的提取与检测

2.6.2 DNase I的消化

2.6.3 RT-延伸实验

2.6.4 cDNA测序

2.7构建启动子-报道子融合体

2.7.1构建P1con：：lacZ质粒pKD102z

2.7.2构建含有luxCDABF报道子的融合质粒

2.7.3 β—galactosidase实验

2.7.4含有lux报告子的基因表达测定

2.8构建orfI敲除突变株

2.9细胞大小的测量

第三章铁反应基因研究结果与讨论

3.1 PA2572的研究

3.1.1 PA2572突变体的构建

3.1.2 PA2572与铁反应基因的关系

3.1.3 PA2572与QS系统的关系

3.1.4 QS系统对PA2572的调节

3.1.5突变体PA01(A2572)的泳动性

3.2 PA3899的研究

3.2.1 PA3899突变体的构建

3.2.2 PA3899对pvdF和tpchDCBA的影响

3.2.3 PA3899和QS系统的相互关系

3.2.4 PA3899对tol-oprL的作用

3.3铁对QS的调节

3.4不同铁浓度下突变体biofilm的生物量

3.5讨论

第四章tol-oprL研究的结果与讨论

4.1 tol-oprL启动子区域的鉴定

4.1.1 P1区域两个启动子的鉴定

4.1.2 Pb和Pp启动子区域的确定

4.1.3 P1con和Plind两个启动子的不同

4.2 QS系统对tol-oprL的调节

4.3 orf1敲除突变体的细胞形态

4.5讨论

结论

参考文献

科研成果

致谢