谷胱甘肽与铜绿假单胞菌致病性及抗生素抗性的关系研究

摘要

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是病人在医院发生感染的第三大条件致病菌，对宿主细胞引起的氧化伤害，是其导致病人感染死亡的原因之一。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是细胞内最重要的抗氧化剂之一，其含量变化与疾病的发生有着密切的关系。资料显示许多肺部疾病如囊肿性纤维化(cysticfibrosis，CF)病人的呼吸道上皮分泌液(epithelial lining fluid，ELF)中，GSH的水平异常低下。由铜绿假单胞菌感染引起的氧化伤害也是导致CF病人症候出现的主要原因之一。因此，在临床实验中已有用吸入GSH的方法来提高CF病人ELF中的GSH水平。另据资料显示，GSH一方面可以减轻抗生素作用细菌时对宿主细胞造成的氧化损害，一方面又消除了一些抗生素所引起的细菌细胞内氧化压力，保护细菌抵御抗生素的抑杀，降低细菌对一些抗生素的敏感性。为了了解GSH在细胞中这种功能上的矛盾，以及和铜绿假单胞菌之间的关系，研究了GSH和铜绿假单胞菌致病性的关系及对不同抗生素敏感性的影响。 为了研究GSH与铜绿假单胞菌致病性的关系，以荧光素酶基因操纵子lux CDABE发光报道基因构建的致病性因子启动子库为平台，外加不同浓度GSH或化学试剂耗竭细胞内GSH，对启动子库进行筛选比较，依据luxCDABE报道子发光值的变化情况，寻找与GSH有关的致病性因子；构建铜绿假单胞菌谷胱甘肽合成酶基因突变体PAOl(AgshB)和谷胱甘肽还原酶突变体PAOl(△gor)，在分子水平进一步确认GSH和这些致病性因子的关系，分析GSH对铜绿假单胞菌致病性的影响。结果发现，GSH对启动子库中exoS、exoY、phzAl和gacA等致病性因子的表达有促进作用，对其余测试过的致病性因子则没有明显影响；铜绿假单胞菌分泌的重要致病因子绿脓菌素( pyocyanin，PCN)的含量，在PAOl(△gshB)中远低于PA01(P＜0.01)；加入GSH后，PCN平均含量在PAOl(△gshB)中从0.47μg/mL提高到1.73μg/mL，差异十分显著(P＜0.01)，在PAO1中从1.3μg/mL提高到1.9μg/mL，差异显著(P＜0.05)，表明GSH对铜绿假单胞菌生产PCN有促进作用。由于exoS、exoY． phzAl、gacA和PCN与群体感应系统(Quorum—sensing，QS)有着密切的关系，我们对GSH和QS系统的关系进行了相关研究，结果发现，QS系统中rhl系统对gshB和gor基因有负调节作用。除了对以上致病性因子产生影响外，发现铜绿假单胞菌外排泵MexXY—OprM的表达在PAO1(△gshB)中显著降低，并通过互补实验证实是由gshB基因的突变引起的，说明GSH对MexXY—OprM的表达有促进作用。 为了研究GSH对抗生素抗菌活性的影响，利用琼脂扩散方法和最低抑菌浓度(MIC)方法，研究了GSH的存在引起的铜绿假单胞菌对不同抗生素敏感性的变化。结果发现，在LB液体中添加3μg/μL的GSH，铜绿假单胞菌对卡那霉素、红霉素、头孢噻肟钠、环丙沙星、羧苄青霉素和硫酸链霉素的敏感性降低，而对四环素的敏感性增加。铜绿假单胞菌对卡那霉素的MIC由240μg/mL增加为1600μg/mL，对四环素的MIC由25μg/mL降为1.25μg/mL，但是对氯霉素和氨苄青霉素并没有明显地影响。GSSG和GSH具有相同的功能，也可以改变PAO1对抗生素的敏感性。在PAO1(△gor)和PAO1(△gshB)两个突变株中，GSSG和GSH同时可以影响抗生素的敏感性，其程度与野生型相同。上述结果显示，GSH影响铜绿假单胞菌对不同抗生素的敏感性与抗生素的种类密切相关，而与氧化型还是还原型谷光甘肽没有关系，因此其作用可能不是通过改变细胞内的氧化还原状态而起作用的。 总之， GSH一方面对exoS、exoY、phzAl和gacA等致病性基因的表达和PCN的产生起到促进作用，一方面可以改变铜绿假单胞菌对不同抗生素的敏感性。本研究的结果对于GSH生物功能的重新认识、GSH在铜绿假单胞菌感染过程中所扮演的角色，以及铜绿假单胞菌的致病性机理研究等方面具有较大的理论价值和实际意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一章绪论

1.1谷胱甘肽的功能与作用

1.1.1自由基和氧化压力

1.1.2 GSH的生物功能

1.1.3 GSH与疾病的关系

1.1.4 GSH与抗生素的关系

1.2铜绿假单胞菌的致病性

1.2.1群体感应系统

1.2.2铜绿假单胞菌的致病性因子

1.2.3铜绿假单胞菌的耐药性机理

1.3本研究的意义

第二章材料和方法

2.1材料

2.1.1实验所用菌株和质粒

2.1.2细菌培养基及培养条件

2.1.3主要试剂

2.1.4主要仪器

2.2实验方法

2.2.1质粒的提取

2.2.2感受态细胞的制备

2.2.3电转化

2.2.4基因表达的测定

2.2.5 PCR扩增

2.2.6与GSH有关的致病性因子筛选

2.2.7gshB基因和gor基因突变体的构建

2.2.8谷胱甘肽合成酶突变体的互补实验

2.2.9 PCN的测定

2.2.10最低抑菌浓度(MIC)测定

2.2.11琼脂扩散法测定抑菌圈大小

2.2.12数据的统计学处理

第三章GSH与铜绿假单胞菌致病性因子关系的研究

3.1外加GSH对致病性因子表达的影响

3.2 BSO和DEM耗竭细胞中的GSH对致病性因子表达的影响

3.3在gshB与gor基因突变体中致病性因子表达的变化

3.3.1突变体的验证

3.3.2在PAO1(△gshB)突变体中致病性因子表达的变化

3.3.3在PAO1(△gor)突变体中致病性因子表达的变化

3.4 GSH对PCN产量的影响

3.5群体密度感知系统对gshB和gor基因的调节作用

3.6 PAO1(△grshB)突变体的互补实验

3.7 GSH对MexXY-OprM外排泵表达的影响

3.8讨论

第四章GSH对抗生素抗菌活性的影响以及自身的抑菌作用

4.1 GSH影响铜绿假单胞菌对抗生素的敏感性

4.1.1 GSH改变铜绿假单胞菌对不同抗生素的MIC

4.1.2琼脂扩散法测定GSH对铜绿假单胞菌抗生素敏感性的改变

4.2 PAO1(△gshB)和PAO1(△gor)对抗生素敏感性的变化

4.3 GSH和GSSG的抑菌作用

4.4讨论

总结

参考文献

附录

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢