结合聚合连接反应和磁性分离系统的单核苷酸多态性检测方法的建立

摘要

随着大量与人类疾病和药物治疗相关的单核苷酸多态性(Single-NucleotidePolymorphism，SNP)的发现，出现了多种对SNP进行检测的方法和技术。然而，大多数方法由于受到检测灵敏度低，需要昂贵的实验设备及试剂，或需要专业操作人员等方面的限制，无法在常规的临床检验中推广使用。
　　 设计特定组成和功能的检测探针，建立了一种对SNP位点、短片段插入或缺失位点进行分型检测的新方法。该法主要包括以下几个步骤：(1)对SNP位点所在片段进行PCR扩增；(2)在DNA聚合酶的延伸作用(Fill-in)和DNA连接酶的连接作用(Ligation)双重特异性保证的基础上，对等位基因的检测位点进行识别；(3)基于磁分离技术的原理，使用链亲和素磁性微粒对含有检测位点等位基因特异性片段进行纯化，减少反应体系中其它成分对后续分型检测的影响，进一步增强检测体系的特异性。(4)对纯化后的等位基因特异性片段进行扩增以增加检测灵敏度；(5)通过琼脂糖凝胶电泳、ELISA检测或通用寡核苷酸芯片技术三种不同方式实现分型检测。
　　 琼脂糖凝胶电泳和ELISA检测实现的分型，不需依靠昂贵的检测仪器及试剂，即可达到快速、特异性好和灵敏度高等特点，该法能够在常规实验室实现对肿瘤组织等不均一样本进行低拷贝等位基因的检测。如果利用通用寡核苷酸芯片技术实现基因分型，可以使用单色荧光标记系统，以简单的荧光扫描设备和简便的结果分析方法实现中、高通量的SNP分型检测。
　　 以苯二异硫氰酸酯(p-phenylene diisothiocyanate/1,4-phenylene diisothiocyanate，PDC)作为双功能交联剂，对氨基末端磁性微粒的表面进行修饰而制备活化磁性微粒。通过将链亲和素共价偶联于活化磁性微粒表面而制备链亲和素磁性微粒用于SNP分型检测研究。
　　 用聚合连接反应-琼脂糖凝胶电泳方法对药物代谢酶基因CYP3A4、CYP2B6和药物靶点基因EGFR(Epidermal growth factor receptor)的8个SNP位点和一个短片段插入/缺失位点进行了检测，结果表明，此方法具有很好的特异性和灵敏度，能够将仅占0.5％比例的突变型等位基因从混合样本中检测出来。对35例非小细胞肺癌组织样本EGFR，c.2573T＞G(L858R)位点的检测结果显示，用聚合连接反应-琼脂糖凝胶电泳方法能够检测出8例杂合子样本，而用常规的直接测序方法仅能够检测出2例杂合子样本。表明此方法具有较高的灵敏度，适合于对肿瘤等不均一组织样本的SNP检测研究。和琼脂糖凝胶检测方法相比，8例杂合子样本的酶联免疫检测结果，其阳性和阴性信号的对比结果更为明显，表明ELISA显色具有更高的灵敏度，同时可实现更大的通量。
　　 以聚合连接反应-通用寡核苷酸检测芯片对药物代谢酶相关SNP检测的技术进行了初步研究，药物代谢酶CYP2D6基因上的7个SNP位点进行芯片检测，各个位点的阳性杂交区域均具有明显的荧光信号值，并且具有明显的阳性和阴性信号对比，显示了建立的聚合连接反应-通用寡核苷酸芯片检测方法能够应用于中、高通量SNP检测。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略语表

声明

第一章绪论：单核苷酸多态性及其检测方法

1单核苷酸多态性及其特点

2单核苷酸多态性研究的意义

2.1 SNP在遗传学中的应用

2.2 SNP与疾病预防

2.3 SNP与复杂疾病或过程的基因定位

2.4 SNP与药物的关系

2.5 SNP在法医研究与亲子鉴定领域的应用

3单核苷酸多态性基因分型检测方法

3.1等位基因特异性识别策略

3.2等位基因特异性识别产物检测方法

3.3问题

4论文的出发点和主要工作

第二章基于磁性分离系统的SNP检测方法的设计

1 SNP检测方法的总体设计思路

2检测探针的设计方法

3等位基因特异性识别反应

3.1聚合连接反应

3.2连接探针的纯化反应

3.3纯化体系的扩增

4等位基因特异性扩增产物的检测

4.1琼脂糖凝胶电泳检测方法

4.2酶联免疫吸附实验(ELISA)检测方法

4.3通用寡核苷酸芯片检测方法

5对短片段的插入／缺失的检测方法

6分型方法的特点的讨论

第三章链亲和素磁性微粒的制备

1实验材料与仪器

1.1材料

1.2试剂

1.3仪器

2实验方法

2.1 PDC活化的磁性微粒的制备方法

2.2苯二异硫氰酸酯对活化氨基末端磁性微粒活化条件的优化

2.3链亲和素在活化磁性微粒表面的偶联

2.4生物素标记寡核苷酸的固定化及生物活性检测

3结果与讨论

3.1功能化磁性微粒的制备

3.2 PDC活化磁性微粒对链亲和素蛋白的偶联

3.3生物素标记寡核苷酸的固定化及生物活性检测

4小结

第四章聚合连接反应-琼脂糖凝胶电泳检测单核苷酸多态性

1材料与仪器

1.1材料

1.2试剂

1.3仪器

2实验方法

2.1聚合连接反应-琼脂糖凝胶电泳检测单核苷酸多态性方法实验流程

2.2检测探针的设计、合成及溶解保存

2.3质粒模板的检测

2.4临床样本的分型检测

3结果与讨论

3.1质粒模板的检测

3.2临床样本的分型检测

3.3样本EGFR，c.2573T>G(L858R)突变位点亚克隆测序验证

4小结

第五章聚合连接反应-酶联免疫吸附实验检测单核苷酸多态性

1材料与仪器

1.1材料

1.2试剂

1.3仪器

2实验方法

2.1实验流程

2.2检测探针的设计、合成及溶解保存

2.3质粒模板的检测

2.4临床样本的分型检测

3结果与讨论

3.1检测条件的优化及特异性和灵敏度检测

3.2临床样本的分型检测

4小结

第六章聚合连接反应-通用寡核苷酸芯片检测单核苷酸多态性

1材料与仪器

1.1材料

1.2试剂

1.3仪器

2实验方法

2.1实验流程

2.2检测探针的设计、合成及溶解保存

2.3质粒模板的检测

2.4药物代谢酶CYP2D6基因突变位点的检测

3结果与讨论

3.1反应条件的优化

3.2 EGFR基因突变位点的检测

3.3药物代谢酶CYP2D6基因突变位点的检测

4小结

全文总结

参考文献

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

作者简介