四氧化三铁磁性复合微球的制备及其在全血基因组DNA自动化提取中的应用

摘要

与传统的核酸纯化方法相比，以Fe3O4磁性复合微球为载体的核酸纯化方法由于其纯化过程不需要离心，避免了交叉污染，提取结果重复性好、稳定性高、操作简单等优点而成为一种非常有前景的纯化方法，目前国内应用于大规模自动化生物分离的磁性微粒产品仍较少。
　　 本研究旨在利用水热合成的方法制备四氧化三铁磁性微粒，并将二氧化硅修饰在磁性微粒表面形成磁性复合微球，使其具有良好的磁响应性和化学稳定性，并将磁性复合微球应用于全血基因组DNA纯化，建立了快速、高效、高质量的核酸自动化纯化体系。主要得到了以下结论：
　　 (1)利用水热合成的方法制备了Fe3O4磁性微粒，并以X射线衍射(XRD)、透射电子显微镜镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、傅立叶红外光谱(FT-IR)、振动样品磁强计(VSM)等分析技术对Fe3O4粒子的物相、微观形貌和磁学性能进行了表征，实验结果表明，制备的Fe3O4磁性粒子粒度大小在200 nm-300 nm范围内，粒径分布均一、大小可控、分散性好，平均饱和磁化强度为72.6 emu/g，室温下接近于超顺磁性。
　　 (2)利用TEOS水解将二氧化硅包覆在Fe3O4磁粒上，制备了具有良好磁响应性和化学稳定性的SiO2@Fe3O4磁性复合微球。并利用XRD、TEM、FT-IR、VSM等分析技术对复合微球进行了表征，其结果表明：复合粒子表面均匀包覆了无定型SiO2壳层，其结构为核壳结构，复合微球的平均饱和磁化强度为68.8 emu/g。
　　 (3)SiO2磁性复合微球在全血基因组DNA纯化上的应用：利用本实验室已建立的核酸纯化试剂体系，以制备的SiO2磁性复合微球为载体，提取全血基因组DNA。经过优化后的DNA纯化体系，换算成每毫升新鲜血液提取的基因组DNA的量平均为29.8μg，经紫外分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示DNA的片段大小在22 Kb左右，电泳中所有DNA均呈均一条带，未发生降解，且纯度较高。将优化的体系与开放式的核酸自动化提取工作站相结合，并对自动化提取过程进行了优化，结果显示：应用自动化纯化体系，换算为每毫升新鲜血液平均可以提取38.9μg的基因组DNA，电泳中所有DNA都呈明亮均一的条带，没有发生降解。对磁性复合微球载体批内差和批间差的测试表明，优化体系的批内差和批间差都在5％以内，重复性好，一个纯化周期80 min内可提取96个样本，大大增加了全血基因组DNA提取的效率，从而建立了一种高效、快速、稳定性的核酸纯化体系，为试剂体系用于大规模自动化的核酸提取及后续的实验奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1磁性纳米粒子

1.1.1磁性纳米粒子的性质

1.1.2磁性纳米粒子的制备方法

1.2磁性复合微粒

1.2.1磁性复合微粒的特征

1.2.2磁性复合微粒的合成方法

1.3 SiO2@Fe3O4磁性复合微球

1.4磁性复合微球在核酸纯化上的应用

1.4.1核酸分离纯化方法

1.4.2用于提纯核酸的复合磁球

1.4.3磁性复合微球用于核酸纯化的优点

1.5论文的出发点和主要工作

1.5.1选题意义

1.5.2研究内容

第二章 Fe3O4磁性微粒的制备与性能表征

2.1材料与仪器

2.1.1材料和试剂

2.1.2主要仪器

2.2实验方法

2.2.1水热合成反应釜制备Fe3O4磁性微粒

2.2.2高压反应釜制备Fe3O4磁性微粒

2.2.3 Fe3O4磁性微粒的表征

2.3结果与讨论

2.3.1制备的磁性微粒的结构

2.3.2反应时间的选择

2.3.3反应温度的选择

2.3.4表面活性剂对Fe3O4磁性微粒的影响

2.3.5尿素的量对Fe3O4磁性微粒的影响

2.3.6乙二醇和水的比例对Fe3O4磁性微粒的影响

2.3.7机械搅拌对Fe3O4磁性粒子性能的影响

2.3.8 Fe3O4微粒磁学性能

2.4本章小结

第三章 Fe3O4@SiO2磁性复合微球的制备与表征

3.1材料与仪器

3.1.1材料和试剂

3.1.2主要仪器

3.2实验方法

3.2.1 Fe3O@4SiO2磁性复合微球的制备

3.2.2 Fe3O4磁性复合微球的表征

3.3结果与讨论

3.3.1 Fe3O4@SiO2磁性复合微粒的形貌结构

3.3.2 Fe3O4磁性复合微粒的磁学性能

3.4本章小结

第四章 Fe3O4@SiO2磁性复合微粒在全血基因组DNA提取中的应用

4.1材料与仪器

4.1.1材料和试剂

4.1.2主要仪器

4.2实验方法

4.2.1 SiO2@Fe3O4磁性复合微粒提取全血基因组DNA的基本流程

4.2.2 Eppendorf epMotion TMX自动化工作站纯化全血DNA的基本流程

4.2.3纯化体系的优化

4.2.4自动化核酸纯化体系的稳定性检测

4.2.5基因组DNA的检测方法

4.3结果与讨论

4.3.1 SiO2@Fe3O4磁性复合微粒手工提取全血基因组DNA的优化

4.3.2 Eppendorf epMotion TMX自动化工作站提取全血基因组DNA的优化

4.4本章小结

全文总结

参考文献

攻读硕士期间研究成果

致谢