基于UPLC-HDMS代谢组学技术研究马兜铃酸肾毒性及其毒理机制

摘要

马兜铃酸肾病（AAN）是一种服用含有马兜铃酸(AA)中药导致的肾脏疾病，目前AAN机理尚不明确，制约着临床上含AA中药的使用。代谢组学是主要研究生物整体内源性代谢物质变化的学科，代谢组学广泛用于疾病诊断和药物毒性研究。
　　目的:
　　基于超高效液相色谱-高清质谱(UPLC-HDMS)代谢组学方法，并结合药理学的方法，对AAN不同阶段导致内源性代谢产物的变化进行系统研究，并阐明病理机制，为含马兜铃酸的中药合理应用提供参考依据。
　　方法:
　　选取体重为200±10g的雄性SD大鼠60只，随机分为AAN模型组和正常对照组，每组30只。模型组大鼠按体重每天灌胃20mg/kg的AA溶液(含0.5％NaHCO3)，对照组大鼠按体重灌胃同等剂量的0.5％NaHCO3溶液，连续灌胃12周，停止给AA后再观察12周，建立AAN大鼠模型。给AA分别在第4、8、12和24周收集尿液、血清和肾组织样品，用于尿液和血清生化指标、组织病理学分析以及尿液、血清和肾组织的代谢组学研究。
　　结果:
　　1.AAN大鼠的尿液代谢组学研究结果:在第4周、第8周和第12周分别鉴定出16、14和15个生物标示物。生物化学途径分析发现AA导致的肾损伤与柠檬酸循环、肠道微生物代谢、氨基酸代谢、嘌呤代谢和胆汁酸合成等扰乱有关。
　　2.AAN大鼠血清代谢组学研究结果:牛磺鹅去氧胆酸、12-酮脱氧胆酸、溶血卵磷脂(15∶0)和二十二碳六烯酸4个代谢产物为早期AAN的血清生物标示物;溶血卵磷脂(22∶5)、硫酸吲哚酚、尿酸和肌酐为晚期AAN大鼠血清生物标示物;模型组大鼠血清中溶血磷脂酰乙醇胺(20∶2)、胆酸、鹅去氧胆酸、胱硫醚亚砜和溶血卵磷脂(17∶0)的含量在各时间点都发生显著改变。生化途径分析发现这些代谢产物主要与脂质、氨基酸和嘌呤的代谢有关。
　　3.AAN大鼠肾组织代谢组学研究结果:甘油三酯、磷脂酰胆碱和溶血卵磷脂等脂质可作为AAN的能区分模型组与正常组的重要代谢产物，AAN不同阶段的发病机理主要与脂肪酸、胆汁酸、甘油脂和磷脂等脂质的代谢异常有关;肾脏的病理组织学考察证明AA肾损伤过程中伴随着炎症和促氧化的激活，导致肾纤维化的发生。
　　结论∶
　　代谢组学方法可用于AAN病理机理的研究，在AAN不同阶段伴随着不同代谢产物的改变。AAN的发病机理主要与肠道微生物代谢、氨基酸代谢、嘌呤代谢、胆汁酸代谢和脂质代谢异常有关。

目录

声明

摘要

缩略词对照表

第一章 绪论

1．1 马兜铃酸研究进展

1．1．1 含有马兜铃酸的中草药

1．1．2 马兜铃酸肾病

1．1．3 马兜铃酸肾病病理机制

1．2 代谢组学在肾毒性评价中的研究进展

1．2．1 代谢组学简介

1．2．2 代谢组学在肾毒性评价中的应用

1．3 本研究的意义

第二章 马兜铃酸诱导的AAN大鼠尿液代谢组学研究

2．1 仪器与材料

2．1．1 实验仪器

2．1．2 药品与试剂

2．2 实验方法

2．2．1 实验动物及模型

2．2．2 尿液样品收集与处理

2．2．3 尿液临床生化指标分析

2．2．4 色谱与质谱条件

2．2．5 统计分析

2．3 实验结果

2．3．1 临床生化指标分析

2．3．2 方法学考察与验证

2．3．3 对照组和模型组的尿液代谢指纹图谱差异

2．3．4 尿液生物标示物鉴定

2．4 代谢产物的生物化学作用机制分析

2．4．1 能量代谢扰乱

2．4．2 肠道菌群代谢

2．4．3 氨基酸代谢

2．4．4 嘌呤代谢

2．4．5 胆汁酸生物合成扰动

2．4．5 氧化应激

第三章 马兜铃酸诱导的AAN大鼠血清代谢组学研究

3．1 实验方法

3．1．1 样品收集与制备

3．1．2 色谱与质谱条件

3．3 实验结果

3．3．1 AA诱导的AAN大鼠血清代谢轮廓和多变量分析

3．3．2 AAN模型大鼠血清生物标示物的鉴定

3．4 AA诱导的AAN大鼠血清生物标示物的生物化学代谢途径分析

3．4．1 AA激活氧化应激代谢途径

3．4．3 胆汁酸合成与分泌的改变

第四章 马兜铃酸诱导的AAN大鼠肾组织代谢组学研究

4．1 实验方法

4．1．1 样品收集与制备

4．1．2 色谱与质谱条件

4．2 AA诱导的AAN大鼠肾组织代谢组学数据分析

4．3 实验结果

4．3．1 AA诱导的AAN大鼠生理生化指标分析

4．3．2 AA诱导的AAN大鼠肾组织病理学结果

4．3．3 AA诱导的AAN大鼠肾组织代谢轮廓分析及生物标示物的鉴定

4．4 AA诱导的AAN大鼠肾组织生物标示物生化作用机制分析

总结

参考文献

致谢

攻读硕士期间取得的科研成果