炎症相关因子与糖尿病大鼠视网膜血管渗漏

摘要

目的:糖尿病性黄斑水肿(DME)是严重的致盲性疾病，其确切的发病机制不明，目前多数人认为DME是一种血管性疾病。已有人将糖皮质激素用于治疗DME，获得可喜的效果，但其治疗DME的机理并不能从微血管病变的角度来解释。由于糖皮质激素是抗炎类药物，能够抑制炎症细胞的移行和炎症介质的释放。由此，该研究试图从炎症的角度来探讨DME的发病机理，为DME的预防和治疗提供新的思路和方法。 材料和方法： 一、高糖及曲安奈德(TA)对视网膜微血管内皮细胞分泌白细胞介素-6(IL-6)的影响。1、细胞培养：取新鲜S-D大鼠眼球，去除眼前节和玻璃体，轻轻剥离视网膜，剪碎，0.25％胶原酶消化2小时，双层100μm滤网过滤后，细胞悬液接种于DMEM培养基(内含20％胎牛血清，100mg/mL青霉素，100μg/mL链霉素，10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，100U/ml肝素)中，定期换液。免疫组化方法检测细胞中Ⅷ因子的表达，以此鉴定内皮细胞。2、高糖及TA对视网膜微血管内皮细胞分泌IL-6的影响：用ELISA方法检测视网膜微血管内皮细胞在下列条件下不同时间(1、2、3、4、5、6天)IL-6分泌的情况：A、正常培养组B、含15mmol/L葡萄糖培养组C、15mmol/L葡萄糖培养3天后加入0.02mgTA处理组D、含30mmol/L葡萄糖培养组E、30mmol/L葡萄糖培养3天后加入0.02mgTA处理组 二、炎症相关因子和糖尿病大鼠视网膜血管渗漏。1、糖尿病大鼠模型诱导：取健康成年雄性S-D大鼠作为研究对象。腹腔注射streptozotocin(STZ)50mg/kg。定期检测空腹血糖。血糖大于等于16.7mmol/L以上或尿糖+++-+++者定义为糖尿病鼠。对血糖逐渐下降者可再次或重复注射40mg/kgSTZ。对照组腹腔注射同等体积柠檬酸缓冲液。2、视网膜血管通透性检查：糖尿病鼠、TA处理鼠，上腔静脉注射2％Evans蓝，5分钟后取眼球，视网膜铺片，于绿色荧光显微镜下观察Evans蓝在血管中的分布情况。3、视网膜组织细胞因子免疫组化检查：糖尿病鼠、TA处理鼠、分别行视网膜冰冻切片，免疫组化方法检测视网膜中白介素-1(IL-1)、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)的表达。4、视网膜血管壁紧密连接蛋白检查：糖尿病鼠、TA处理鼠，通过视网膜组织直接浸泡，免疫组化方法检测视网膜血管壁紧密连接蛋白claudin的分布及表达情况。 三、统计分析采用SPSS10.0统计分析软件以P＜0.05为统计学意义结果。1、培养的内皮细胞呈铺路石状单层生长，经免疫组化鉴定，呈Ⅷ因子阳性，阳性颗粒分布于细胞浆，证实为血管内皮细胞。 2、正常条件下血管内皮细胞可以自发分泌一定量的IL-6，并随着培养天数的增加而增加，于6天左右开始下降。高糖环境可以促进内皮细胞IL-6的分泌，并于72小时达到高峰，随后分泌量逐渐下降。加入0.02mgTA后能抑制IL-6的分泌。3、在糖尿病诱导3月后，出现类似人类DR表现的视网膜血管异常，即部分血管发生渗漏、无灌注区等；眼内应用TA后血管渗漏明显减轻。4、糖尿病大鼠视网膜存在IL-1、IL-6、TNF的表达；TA能明显抑制IL-1、IL-6、TNF的表达。5、正常大鼠视网膜血管壁紧密连接蛋白主要分布于外层的视网膜微血管壁和内层的小动脉壁；而在糖尿病大鼠中，紧密连接蛋白表达的量明显减少，并且分布不均匀，显断续状；TA能部分逆转，使其表达的量增加。 结论：1、视网膜微血管内皮细胞可以自发分泌IL-6；2、高糖环境可以促进视网膜微血管内皮细胞IL-6的分泌，TA可以抑制高糖培养视网膜微血管内皮细胞IL-6的分泌；3、糖尿病鼠诱导3月后，出现视网膜血管渗漏，TA应用后可使血管渗漏减轻；4、糖尿病鼠视网膜内存在IL-1、IL-6、TNF炎症相关性细胞因子的表达。眼内应用TA能够明显抑制IL-1、IL-6、TNF炎症相关性细胞因子的表达；5、糖尿病鼠视网膜血管壁紧密连接蛋白表达量减少，分布不均匀，TA能部分逆转上述改变。

目录

研究生导师和课题指导小组介绍

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引言

第一部分：高糖及TA对大鼠视网膜微血管内皮细胞分泌IL-6的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分：炎症相关因子的表达与糖尿病大鼠视网膜血管渗漏

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

糖尿病性黄斑水肿的研究现状

参考文献

图片（一）

图片（二）

图片（三）

图片（四）

攻读学位期间研究成果

致谢