山东省弓形虫感染流行病学调查及传播因素分析

摘要

弓形虫病是世界性流行的人畜共患病之一，由细胞内专性寄生性原虫一刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)感染引起的全身性疾病。弓形虫感染多种动物，猫科动物为终末宿主，人类免疫正常者虽多为隐性感染，但弓形虫眼病、肝病的临床报道屡见不鲜，甚至可以引起弓形虫脑病，更是免疫功能低下和免疫功能缺陷者最为常见的感染来源和死亡原因之一。孕妇感染可以导致胎儿畸形、流产、死胎等不良孕产结果，是计划生育、优生优育的大敌。估计世界人口的30％可能携带该寄生虫，美国人群血清学阳性率为22.5％，萨尔瓦多40岁年龄组血清学阳性率高达75％；我国人口血清学平均阳性率为5％-20％，且有不断上升的趋势。虽然爆发流行多与食品和水污染有关，但不能解释逐年升高的现象；国内外调查结果普遍认为饲养动物与弓形虫感染有关，但危险程度如何，相对危险度为多少，未见报道。为摸清人类感染的主要来源，更好地控制和预防弓形虫病的传播，该课题进行了人群血清流行病学调查。在济宁、枣庄、临沂随机选择1-2个居民区，入户调查，每人一表，养狗和养猫者及(1：1)对照各采血0.5-1ml，对照选择性别、年龄、住址和职业相同者，统一编号后带回实验室分离血清。酶联免疫吸附法检测弓形虫抗体，试剂为卫生部全国人体重要寄生虫病现况调查办公室统一提供、珠海经济特区海泰生物制药有限公司生产的弓形虫IgG抗体酶免检测试剂盒。调查人员统一培训，统一方法，实验采用双盲法。共调查500人，检出阳性者79人，总体阳性率为17.54％。其中58例同时养狗和猫者16人阳性，阳性率为27.59％，未作对照；单纯养狗或猫者及其对照442人，63人抗体阳性，阳性率为14.25％。不养宠物者221人，19人阳性，阳性率为8.60％；养宠物者221人，阳性44人，阳性率为19.91％，两组差异非常显著，x2=11.57，P＜0.001。单纯养狗者127人，21人阳性，阳性率为16.54％；单纯养猫者94人，23人阳性，阳性率为24.47％。单纯养狗者、单纯养猫者、同时养狗和猫者的比值比(OR)分别为2.106、3.444、4.05，即感染机会为对照组的2-4倍。归因危险性分别为52.38％、70.96％、75.31％，也就是说单纯养狗者中52％的感染由于养狗所致，单纯养猫者约71％的感染因养猫所致，同时养狗和猫者约75％的感染由此而得。宠物热似乎是城市人口弓形虫感染升高的主要原因，但不能解释农村人口弓形虫感染率的上升。饭前便后每次洗手和经常洗手者感染率为13.19％，偶尔和从不洗手者感染率为34.04％，两组差异显著(x2=14.53，P＜0.01)。显示个人卫生状况与弓形虫感染密切相关，随着社会经济的发展和人均教育水平的提高，个人卫生状况有了显著改善，显然不是弓形虫感染率上升的原因。吃生鸡蛋组感染率(21.05％)明显高于不吃生鸡蛋组(13.61％)，具有统计学显著性意义(x2=4.59，P＜0.05)。有喝生乳习惯者6人，阳性3人，无此习惯者436人中60人阳性(x2校=3.74，P≈0.05)。ChiariCdeA等(1984)与SkinnerLJ等(1990)先后报道了喝未消毒山羊奶感染弓形虫病的实例，并在羊乳中分离到弓形虫。PowellCC.等再次报道，6只实验感染猫有5只乳液中检测到弓形虫(PCR与小鼠接种法)。虽然吃生鸡蛋、喝生乳为弓形虫感染途径之一，但人群中有此习惯者仅为少数，仍然不能解释十年间弓形虫感染率如此大幅的上升。国外学者报道猪、羊肉是一种潜在的传染来源；随着生活水平的提高，商品肉的人均消耗量增加，由于食品加工过程生熟不分(50％-95％的家庭不能作到生熟案板分开)造成交叉污染和追求味道鲜美的过程中食入半生不熟的肉制品，误食包囊和速殖子感染的机会大大增加。该课题应用巢式PCR技术对商业肉制品弓形虫污染率进行了调查。以速殖子表面抗原(SAG2)基因为目的基因，设计5'端外源性引物、内源性引物，扩增终产物为241-bp核苷酸片段；3'端外源性引物、内源性引物，扩增终产物为221-bp核苷酸片段.25μ1反应体系，外源性上下引物、模板、dNTP各1μl，buffer2.5ul，水18μl，Taq酶0.5μl，94℃预变性2分钟，94℃变性40秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，32个循环，72℃延伸7分钟。再以扩增产物为模板，相同条件下用内源性引物扩增。扩增产物进行3％琼脂糖电泳证实达到设计要求。用宿主DNA提取液(0.06-0.3μg/μl)加入1μl弓形虫阳性模板，倍比稀释后检测发现，稀释50-100倍检测效果最好，检出最低浓度为10-5μg/μl。在每克标本中加入1-5个原虫时检出结果良好，敏感性达到预期目标，具备国际同类方法先进水平。共检测动物标本89份，阳性22份，阳性率为24.72％。其中猪肉标本56份，16份阳性，阳性率为28.57％；羊肉标本33份，6份阳性，阳性率为18.18％。可疑病人血标本1份，阳性。结果证明，肉类污染率较高，山东省动物感染较为普遍，但与十年前相比不如人群感染变化明显，是否与人群间流行型有所不同?弓形虫为顶复门球虫亚纲原虫，染色体为单倍体(在猫科动物体内有性生殖除外)，包含8x107个碱基对，依据主要表面抗原SAG2基因不同分为三型，PCR纯化产物分别以Sau3AI(5'端)和HhaI(3'端)酶切(37℃4小时)，酶切产物进行3％琼脂糖凝胶电泳。Ⅰ型，两端均不可切；Ⅱ型，3'端可切；Ⅲ型，5'端可切。各型毒力和流行病学不同，Ⅰ型、Ⅱ型为人类感染的主要类型，Ⅰ型毒力强，多见于先天性感染，Ⅲ型次之，多为动物感染，Ⅱ型为弱毒株，多见于免疫抑制或免疫功能低下患者。血清学可以检测到型特异性抗体,。但也有不同报道，有人认为动物感染以Ⅱ型为主，TanyaV.Aspinall等(2002)报道，27份肉制品全部Ⅰ型阳性，其中6份为Ⅰ型与Ⅱ型混合阳性。国内尚未见有关弓形虫SAG2分型研究的报告。弓形虫SAG2分型研究，不仅有重要的流行病学意义，帮助更好地了解人畜间传播的方式与途径，对于临床预后判断、治疗方案的制定以及药物与疫苗的开发研究有着极为重要的意义。因而该课题在应用巢式PCR技术对商业肉制品弓形虫污染率调查的基础上进行了SAG2临床分型(具体操作见材料与方法)。22份阳性标本中单纯Ⅰ型18份(81.82％)，单纯Ⅱ型1份，Ⅱ型与Ⅰ型混合感染2份(9.09％)，Ⅲ型未能检测到。其中，猪肉标本16份阳性，Ⅰ型13份，Ⅱ型以及Ⅰ型与Ⅱ型混合感染各1份，未能定型1份；羊肉标本33份，6份阳性，Ⅰ型5份，Ⅱ型与Ⅰ型混合感染1份。可疑病人血标本1份为Ⅰ型阳性，与绝大多数报道人类感染型为Ⅰ型和Ⅱ型的结果是一致的。动物感染单纯Ⅰ型占81.82％，加上混合感染，90.91％的动物感染了Ⅰ型，与人类感染型一致，证明猪、羊肉确为人类潜在的传染来源。 综上所述，该课题成功建立了弓形虫SAG2基因检测与分型研究方法。山东省人与动物弓形虫感染率均很高。主要商业肉制品(猪肉、羊肉)弓形虫污染率很高，以Ⅰ型为主，是人类重要的潜在感染来源之一。随着生活水平的提高，商品肉的人均消耗量增加，由于食品加工过程生熟不分(50％-95％的家庭不能作到生熟案板分开)造成交叉污染和追求味道鲜美的过程中食入半生不熟的肉制品，误食包囊和速殖子感染成为山东省人群弓形虫感染率大幅增高的主要因素。养狗/猫与弓形虫感染密切相关。宠物热是城市人口弓形虫感染率大幅上升的又一重要原因。培养良好的卫生习惯，饭前便后勤洗手，依然对预防弓形虫感染有重要作用。要改变这一现状，必须从根本入手，在作好卫生宣教和人群防治的同时，积极开发畜体疫苗，加强畜牧检疫，降低商业肉制品的污染率。

目录

课题指导小组人员

学位论文独创性声明及学位论文知识产权属声明

主要符号表

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附录

弓形虫检测方法的研究进展

已发表和待发表和论文

致谢