我国艾滋病流行现况及补体激活蛋白CR2-Fc抑制HIV感染的实验研究

摘要

目的:
　　了解近十年我国艾滋病三间分布特征及流行趋势，为艾滋病防治提供线索。探讨补体在艾滋病发病中的作用及其机制，通过靶向补体激活蛋白CR2-IgG1Fc(以下简写CR2-Fc)抑制HIV感染的实验研究，为艾滋病防控提供新思路。
　　方法:
　　1.描述性分析
　　(1)数据来源与数据整理
　　2004-2013年度我国31个省（直辖市、自治区）艾滋病发病及死亡疫情数据（不含港、澳、台）来源于中国疾病监测信息报告管理系统;各省份人口数据来源于国家人口与健康科学数据共享平台;1∶400万的全国省（直辖市、自治区）级电子地图来源于国家地理信息研究所。将所得数据分类、筛选后导入Excel2010。
　　(2)研究方法
　　采用描述性流行病学分析方法对2004-2013年我国艾滋病流行现状进行分析，重点描述艾滋病的三间分布特征及流行趋势。
　　(3)统计分析方法
　　将导入Excel2010的数据建立数据库，用SAS9.2统计软件对发病率、死亡率和构成比等研究指标进行统计分析，率和构成比的比较用x2检验。利用Excel2010、GraphPad Prism5.0软件进行图表处理。
　　2.靶向补体激活蛋白CR2-Fc的表达、活性检测及抑制HIV感染体外实验
　　(1)补体激活蛋白CR2-Fc的表达与纯化
　　将PCR扩增得到的人CR2(SCR1-4)基因和人IgG1Fc基因进行连接并构建入T载体。XbaⅠ和NotⅠ双酶切测序正确的重组T载体和pCI-neo真核表达载体，应用T4连接酶将CR2-Fc基因连接到真核表达载体中，得到重组真核表达载体pCI-neo/CR2-Fc。重组真核表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，G418筛选获得稳定表达细胞株。RT-PCR、Western blot检测目的蛋白CR2-Fc的表达。稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株进行无血清培养，培养上清应用proteinG琼脂糖亲和纯化柱进行目的蛋白的亲和纯化。应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gelelectrophoresis，PAGE）和BCA蛋白定量法对纯化后的CR2-Fc蛋白进行检测。
　　(2) CR2-Fc蛋白生物活性鉴定与抑制HIV感染体外实验
　　绵羊红细胞溶解实验判断CR2-Fc激活补体的能力，即在补体致敏的反应体系中加入梯度稀释的CR2-Fc蛋白，判断CR2-Fc的含量与补体活化程度之间的剂量-效应关系。应用Anti-CR2 mAb(clone1048)封闭CR2-Fc的C3d结合位点，观察溶血变化;流式细胞术检测CR2-Fc与细胞表面的C3d结合靶向性，使用APC标记的Anti-C3d mAb和FITC标记的Anti-CR2 mAb两种抗体检测细胞表面的双荧光信号;PBS替代CR2-Fc或EDTA阻断C3d沉积，观察细胞表面荧光变化。
　　游离HIV杀伤实验，即在含等量HIV-1体系中加入梯度稀释的CR2-Fc分子活化补体，48h后分别感染相同数量Tzm-BL细胞。HIV感染Tzm-BL细胞后即激活荧光基团，通过检测细胞荧光强度可以推断HIV数量，间接判断HIV杀伤率;ATP荧光法评估CR2-Fc对感染HIV细胞的影响，即通过ATP产生的荧光信号估计活细胞数，以此判断CR2-Fc溶解细胞的能力。在HIV-1感染的H9细胞中加入不同浓度的CR2-Fc以及等量的正常人血清共同孵育，检测细胞的ATP荧光值。
　　结果
　　1.2004-2013年我国艾滋病流行现状的描述性流行病学分析
　　(1)2004-2013年，我国艾滋病年均发病率为1.67/10万，年均死亡率为0.48/10万。近10年来，我国艾滋病发病率、死亡率均呈逐年上升趋势（发病率变化趋势卡方检测Z=295.27，p＜0.05;死亡率变化趋势卡方检验Z=154.06，p＜0.05）。发病率由2004年的0.28/10万升至2013年的3.06/10万，增幅达992.86％;死亡率由2004年的0.06/10万升至2013年的0.83/10万，增幅为1283.33％。
　　(2)2004-2013年，全国31个省（直辖市、自治区）均有艾滋病病例报告，发病率高于1/10万的省份由2004年的1个上升到了2013年的21个。我国艾滋病疫情呈现流行范围广和地区差异大的特点。艾滋病高发区主要集中在我国西南部，广西省艾滋病年均发病率为6.51/10万居全国首位，其它发病率较高的省份依次是云南、新疆、河南，发病率分别为5.29/10万、3.89/10万、2.10/10万。年均发病率较低的3个省份依次为:山东省0.12/10万，内蒙古0.13/10万和西藏0.16/10万。
　　(3)2004-2013年我国艾滋病发病人群男性明显多于女性，男性病例占到总病例数的70.48％，男女病例性别比为3.88∶1。近10年男女病例性别比呈逐年增高趋势（趋势卡方检验Z=32.17，p＜0.05），比值由2004年的1.92∶1上升至2013年的2.97∶1。从年龄分布来看，艾滋病发病以青壮年为主，20-59岁病例占到总病例的86.35％。其中30-39岁年龄组为艾滋病高发年龄组，病例数占总报告病例的32.38％，其次是40-49岁年龄组的21.67％和20-29岁年龄组的20.57％。0-9岁年龄组病例最少，仅占全部病例的1.12％。
　　2.靶向补体激活蛋白CR2-Fc的表达、活性鉴定及抑制HIV感染体外实验
　　(1)重组真核表达载体的构建、CR2-Fc蛋白的表达与纯化
　　利用PCR成功合成了人CR2(SCR1-4)基因和人IgG1Fc基因，1％琼脂糖凝胶电泳可见CR2-Fc基因条带位于1，800bp处;双酶切重组真核表达载体，电泳可见5，800bp和1，800bp两条条带，与预期结果一致;CR2-Fc基因的测序结果与GenBank中序列一致，证实目的基因准确无误。RT-PCR检测细胞内mRNA:1％琼脂糖凝胶电泳显示目的条带约1800bp，与预期一致，证明细胞内存在CR2-Fc的转录。使用Anti-CR2 mAb(clone1048)以及Anti-IgG1Fc mAb分别作为检测抗体对细胞转染上清进行Western blot检测，结果显示:还原态样本位于60kDa处，与预期结果一致;非还原态样本位于130kDa处，提示自然条件下CR2-Fc以二聚体的形式存在。空载体转染上清作对照未见条带;纯化样本进行SDS-PAGE检测，结果显示:还原态样本位于60kDa处，非还原态样本约为130kDa，结果与Western blot结果一致。Quantity One软件分析SDS-PAGE结果，样本蛋白纯度大于90％。BCA法蛋白定量得到CR2-Fc蛋白浓度约为900μg/ml。
　　(2) CR2-Fc生物活性鉴定及抑制HIV感染体外实验
　　蛋白活性鉴定:溶血实验结果，显示随着CR2-Fc浓度增加，红细胞溶解率显著提高（趋势卡方检验Z=2.12，p＜0.05）。添加过量的Anti-CR2 mAb(clone1048，250μg/ml)，溶血率未发生明显变化，表明Anti-CR2 mAb能竞争性抑制CR2-Fc与C3d的结合作用;流式细胞术检测结果显示:正常激活补体并加入CR2-Fc分子，能够在细胞表面检测到APC及FITC双荧光信号;正常激活补体并用PBS取代CR2-Fc分子，只能在细胞表面检测到APC荧光信号;42mM EDTA阻断补体激活，则无APC和FITC荧光信号检出。
　　抑制HIV感染体外实验:利用Tzm-BL细胞荧光法检测CR2-Fc对游离HIV杀伤能力，结果发现，当低浓度中和抗体存在时，融合蛋白CR2-Fc能够靶向结合于HIV-1表面的C3d分子，通过级联放大激活补体，提高补体溶解HIV的作用。随着CR2-Fc分子浓度增加，HIV-1杀伤率增加，当CR2-Fc浓度为10.31μM达到峰值，HIV-1的杀伤率为34.26±6.43％。用C6缺陷血清取代NHS后，荧光信号未见明显变化;ATP荧光法结果提示，补体对H9细胞表面HIV杀伤能够引起细胞溶解。随着CR2-Fc浓度增加，溶解受感染细胞能力增强，细胞溶解率由-2.10±3.52％（CR2-Fc浓度0.01μM）上升至18.49±4.28％（CR2-Fc浓度10.31μM）。用C6缺陷血清替代正常人血清，荧光检测结果未见明显变化。
　　结论
　　近十年我国艾滋病疫情发病率及死亡率呈现逐年升高趋势，艾滋病发病具有疫情分布广、地区差异大的特点，因此目前我国艾滋病疫情依然严峻，防控形势不容乐观;为进一步提高艾滋病的防治能力，本研究针对补体在艾滋病感染机制中的作用和特点，构建并表达了一种新型靶向局部补体激活蛋白CR2-Fc。实验证实，CR2-Fc具有很好的生物学活性及抑制HIV-1感染能力。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

第一部分 2004-2013年我国艾滋病分布特征的描述性分析

1．概述

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第二部分 CR2-Fe抑制HIV感染的实验研究

第一节 融合蛋白CR2-Fc的表达与纯化

1．概述

2．材料、仪器和方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第二节 靶向补体激活蛋白CR2-Fc生物活性鉴定及抑制HIV感染体外实验

1．概述

2．材料、仪器和方法

3．结果

4．讨论

5．结论

讨论

结论

参考文献

附录

综述 补体C3促进HIV-1感染的作用

作者简介

致谢